沈雪飛，翟新新，溫振才，孫 真，賈生美，盧 強(qiáng)

嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白基因flaB的克隆、表達(dá)及其免疫原性分析

沈雪飛，翟新新，溫振才，孫 真，賈生美，盧 強(qiáng)

目的 克隆、表達(dá)及純化嗜水氣單胞菌鞭毛FlaB蛋白，比較了它與天然鞭毛蛋白的抗原性，為以后魚類弧菌病的防治及其疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。方法 利用PCR擴(kuò)增出嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白基因flaB，經(jīng)確定后將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET-30a中，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了表達(dá)，并用電洗脫法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，用純化的重組蛋白免疫家兔制備抗血清，并進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果 嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白flaB基因全長(zhǎng)912 bp，編碼303個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為32 kDa，Western-blot結(jié)果表明兔抗FlaB血清不僅能與重組鞭毛蛋白發(fā)生反應(yīng)，而且能與天然鞭毛蛋白發(fā)生反應(yīng)。結(jié)論 鞭毛蛋白FlaB可能是嗜水氣單胞菌的重要保護(hù)抗原之一，為下一步疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。

嗜水氣單胞菌；鞭毛；蛋白

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬于弧菌科、氣單胞菌屬，是水生環(huán)境中普遍存在的一種細(xì)菌，能夠感染多種水生和陸生動(dòng)物，是一種重要的人-獸-魚共患的細(xì)菌病原菌[1]。嗜水氣單胞菌可以使淡水魚類發(fā)生癤病和敗血癥，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重危害[2]。人感染致病性嗜水氣單胞菌后會(huì)發(fā)生腹瀉、食物中毒、繼發(fā)感染的臨床癥狀，嚴(yán)重威脅到人類公共衛(wèi)生安全[3-5]。

與其他生物一樣，嗜水氣單胞菌的致病性與其產(chǎn)生多種毒力因子有著直接關(guān)系，毒素是其致病的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)菌粘附于宿主細(xì)胞表面是對(duì)機(jī)體感染致病的先決條件，對(duì)細(xì)菌侵入宿主并有效發(fā)揮毒素等作用具有重要的意義[6]。鞭毛就是一種重要的粘附因子，它在黏附、生物膜形成以及病原菌定植過(guò)程中起著重要作用[7-8]。

鞭毛的形成過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的一連串的事件，需要協(xié)調(diào)表達(dá)超過(guò)50個(gè)基因編碼的結(jié)構(gòu)亞單位、調(diào)節(jié)蛋白和化學(xué)傳感器。根據(jù)在組裝蛋白時(shí)間順序可以把這些基因分為3類：早期、中期和晚期基因[9-10]。早期基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白，控制整個(gè)調(diào)節(jié)子的表達(dá)；中期基因編碼鉤狀體、基礎(chǔ)小體、傳輸結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)晚期表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白；晚期基因表達(dá)包括絲狀體、鞭毛馬達(dá)和趨化蛋白因子。

鞭毛由基體、鉤狀體和絲狀體三部分組成[11]。(1)基體：基體由MS-C環(huán)、轉(zhuǎn)動(dòng)桿和LP環(huán)組成。位于鞭毛根部，嵌在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中，其功能是一個(gè)可逆旋轉(zhuǎn)馬達(dá)，給鞭毛的運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力。(2)鉤狀體：鞭毛伸出細(xì)胞壁后的部分稱為鉤狀體，高度彎曲的管狀結(jié)構(gòu)，可以改變鞭毛運(yùn)動(dòng)方向。(3)絲狀體：絲狀體呈絲狀連接在鉤狀體后面，由FlaA和FlaB兩個(gè)鞭毛蛋白單體緊密纏繞而成。其中鞭毛絲狀體蛋白基因位于Region2區(qū)上，主要有FlaA和FlaB兩個(gè)蛋白單體組成。本研究克隆和表達(dá)了嗜水氣單胞菌鞭毛FlaB蛋白，用純化的鞭毛蛋白免疫家兔制備了抗血清，Western-blot對(duì)其免疫原性進(jìn)行了分析，為嗜水氣單胞菌疫病的防治及其疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔，購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品所。

1.2 菌株和質(zhì)粒 嗜水氣單胞菌AHCS-02和嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白由本實(shí)驗(yàn)室保存，嗜水氣單胞菌天然鞭毛蛋白由本實(shí)驗(yàn)室純化保存，E.coliDH5α、BL21(DE3)、表達(dá)載體pET-30a均有本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pUC18購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑 T4 連接酶，Taq plus聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI，DNA Marker DL 5 000 bp/2 000 bp 均購(gòu)自TaKaRa公司、細(xì)菌基因組提取試劑盒 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技公司、DNA凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒 均購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物公司、蛋白Marker購(gòu)自北京全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 用康為世紀(jì)公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取嗜水氣單胞菌基因組DNA，操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 目的基因flaB的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中登錄的嗜水氣單胞菌AH-1鞭毛基因flaB的序列(DQ650656.1)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物上游引物：上游引物：5′-CGGAATTCATGGCCATGTACATCAAC-3′(下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn))，下游引物：5′-CGCTCGAGACCCAGCAGGGACAG-3′(下劃線為XhoI酶切位點(diǎn))，以上引物由華大基因公司合成。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s。30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定并回收目的條帶。

1.2.3 構(gòu)建原核表達(dá)載體 用EcoR I和XhoI雙酶切PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-30a，將膠回收的PCR酶切產(chǎn)物和載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pET30a-flaB，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，涂于含有20 μg/mL的卡那霉素LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，并送至長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司測(cè)序。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 取測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液50 μL接種到若干個(gè)5mLKan+(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)1～1.5 h至OD600值0.6～0.8時(shí)，取出一管作未誘導(dǎo)對(duì)照，然后進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化：實(shí)驗(yàn)組加入IPTG終濃度為(mmol/L)一次為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0在37 ℃，160 r/min誘導(dǎo)6 h；同時(shí)空載體pET-30a(+)轉(zhuǎn)化的E.coliBL21(ED3)作誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)對(duì)照。

1.2.5 表達(dá)形式的鑒定 將表達(dá)菌以1∶100的比例加入Kan+(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩揺菌至OD值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，6 h后收集菌液。4 ℃,5 000 r/min離心20 min，用PBS懸浮沉淀，置冰浴中，超聲破碎使菌液變的清亮，離心分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.6 重組蛋白的純化及Western-blot鑒定 重組質(zhì)粒pET30a-flaB轉(zhuǎn)化E.coliBL21(ED3)菌后，經(jīng)終濃度為0.6 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h后，超聲裂解提取包涵體經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用KCI染色，切取目的條帶后，利用電洗脫法將目的蛋白洗脫出來(lái)，后經(jīng)透析、濃縮純化出重組鞭毛蛋白，用抗His標(biāo)簽的二抗對(duì)目的蛋白進(jìn)行Western鑒定。

1.2.7 抗體的制備 以純化的重組鞭毛蛋白包為抗原，免疫家兔，具體免疫方案如下：初次免疫用500 μg的抗原和等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，采取背部皮下多點(diǎn)免疫，12 d后耳靜脈采血測(cè)效價(jià)；二免，用250 μg的抗原與等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，背部皮下多點(diǎn)免疫，12 d后耳靜脈采血測(cè)效價(jià)；第4次免疫后的第7 d進(jìn)行心臟采血，37 ℃靜置1 h后，4 ℃靜置過(guò)夜，10 000 g離心10 min，上清即為兔抗重組鞭毛蛋白的免疫血清，吸取上清分裝于1.5 mL的離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 重組蛋白的免疫原性分析 將誘導(dǎo)后的重組鞭毛蛋白和天然鞭毛蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將其上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜。加入抗血清(兔抗FlaB血清)，室溫孵育1～2h，用TBST洗3次(5 min/T)，加入1∶10 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔)，室溫孵育1 h；用TBST洗3次(5 min/T)，蛋白檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因電泳分析 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖核酸電泳，發(fā)現(xiàn)有912 bp大小的特異性條帶，與預(yù)期相符，見(jiàn)圖1；重組表達(dá)載體pET-30a-flaB雙酶切電泳，發(fā)現(xiàn)有912 bp大小的目的條帶，見(jiàn)圖1，說(shuō)明目的基因成功的連接到表達(dá)載體上。

1：flaB基因PCR產(chǎn)物；

2.2flaB的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化 pET30a-flaB質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)宿主菌后，用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明：IPTG誘導(dǎo)后的工程菌目的蛋白均有表達(dá)，在38 kDa處有一新的蛋白帶與預(yù)期的分子量相符。而未誘導(dǎo)的陽(yáng)性菌和未誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)菌均沒(méi)有相應(yīng)的蛋白帶，見(jiàn)圖3。

2.3 表達(dá)形式的鑒定 誘導(dǎo)8 h后的培養(yǎng)基，菌體離心、超聲破碎后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明：經(jīng)0.6 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h，重組蛋白絕大部分以包涵體形式存在，可溶性蛋白較少，見(jiàn)圖4。

2.4 FlaB蛋白的純化及鑒定 見(jiàn)圖5。

1：pET-30a-flaB的雙酶切產(chǎn)物

M：蛋白marker(14-100kDa)；1：未誘導(dǎo)的pET-30a2：誘導(dǎo)的pET-30a；3：未誘導(dǎo)的30a-flaB4-8：不同IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L)誘導(dǎo)的30a-flaB

M：蛋白marker(14-100 kDa)；1：誘導(dǎo)上清 2：誘導(dǎo)包涵體沉淀

2.5 重組蛋白免疫原性分析 見(jiàn)圖6。

3 討 論

嗜水氣單胞菌在自然環(huán)境中分布很廣，尤其是在水環(huán)境中最多。嗜水氣單胞菌疾病的頻發(fā)不僅給我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大經(jīng)濟(jì)損失，而且還嚴(yán)重威脅到人類公共衛(wèi)生安全。目前，對(duì)該病的防治主要依靠化學(xué)藥物和抗生素，盡管抗生素可以用于細(xì)菌性魚病的治療，但是重復(fù)使用抗生素可產(chǎn)生耐藥性致病菌或抑制魚的免疫系統(tǒng)[12]。此外，藥物的殘留危害到消費(fèi)者的飲食健康，因而開發(fā)高效、安全的疫苗成為今后防治嗜水氣單胞菌疾病的重要方向。Snieszko和Schaperclaus早期嘗試用疫苗免疫防治魚類細(xì)菌性疾病。在20世紀(jì)60年代， Klontz和Fryer通過(guò)口服免疫防治虹鱒魚的“紅嘴病”[13]。嗜水氣單胞菌有極生單鞭毛，其主要成分是蛋白，在感染與免疫以及細(xì)菌分類鑒定等方面發(fā)揮重要的作用，特別是鞭毛蛋白的免疫原性在疫苗開發(fā)及疫病防控方面有重要的實(shí)際意義。

本研究擴(kuò)曾出嗜水氣單胞菌鞭毛flaB全長(zhǎng)基因，并成功誘導(dǎo)表達(dá)出FlaB鞭毛蛋白，制備了兔抗FlaB多克隆抗體，初步探討了重組鞭毛蛋白FlaB的免疫原性，為新型抗菌素及疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)，對(duì)魚類疾病的防治具有一定的指導(dǎo)意義。

M：蛋白Marker(14-100kDa);1：全菌蛋白；2：純化后的包涵體3：純化后蛋白Western-blot

M：蛋白Marker；1：陰性對(duì)照;2：重組鞭毛蛋白FlaB；3：天然鞭毛蛋白

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Cloning, expression and antigenicity analysis of recombinantAeromonashydrophilaflagellar FlaB protein

SHEN Xue-fei,ZHAI Xin-xin,WEN Zhen-cai,SUN Zhen,LU Qiang

(KeyLaboratoryforZoonosis,MinistryofEducation,InstituteofZoonosis,JilinUniversity,Changchun130062,China)

We expressed flagellar FlaB protein ofAeromonashydrophilainE.coliand analyzed its immunogenicity. In this study, the flagellar geneflaBofAeromonashydrophilawas amplified by PCR from theAeromonashydrophilagenome, and cloned into the prokaryotic expression vector pET30a. After being sequenced, the recombinant plasmid pET30a-flaBwas transformed into strain BL21 (DE3), and FlaB protein was expressed by the recombinant strain after IPTG induction. By SDS-PAGE and electrophoresis elution purification, the purificated recombinant protein was inoculated to New Zealand rabbits. The full-length ofAeromonashydrophilaFlaB flagellin genes was 912 bp, which encodes 303 amino acids. The molecular weight of the induced protein was about 32 kDa as expected. Our result showed that the rabbit antibodies raised against the recombinant could recognize the natural flagellin and the recombinant protein, suggesting flagellin FlaB may be an important protective antigen ofAeromonashydrophilaand has potential for a novel target for vaccine development.

Aeromonashydrophila; flagellar; protein

Lu Qiang, Email: qlu@jlu.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.002

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972277)；吉林大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(200903250)

盧強(qiáng)， Email: qlu@jlu.edu.cn

吉林大學(xué)人獸共患病研究所，長(zhǎng)春 130062；

R378.3

A

1002-2694(2015)03-0199-04

Supported by the National Science Foundation of China(30972277)；the Fundamental Research of Jilin University(200903250)

2014-05-20；

2014-07-31