李少東,周英斌,劉曉莉,禇 晗,李思瑾,田喜鳳,王 洋

C2株藍氏賈第鞭毛蟲SUMO特異性蛋白酶基因的克隆、生物信息學(xué)分析及其催化活性區(qū)的原核表達

李少東,周英斌,劉曉莉,禇 晗,李思瑾,田喜鳳,王 洋

目的 克隆C2株藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia，簡稱賈第蟲)的SUMO-Specific Protease(SENP)基因，并對其序列進行生物信息學(xué)分析，原核表達賈第蟲SENP的催化活性區(qū)。方法 提取C2株賈第蟲基因組DNA，以基因組DNA為模板獲得SENP編碼區(qū)全長片段，連入克隆載體pGM-T，測序后進行生物信息學(xué)分析；根據(jù)分析結(jié)果克隆SENP的催化活性區(qū)，構(gòu)建其原核表達載體pET-28a(+)-SENPc，在E.coliRosetta(DE3)中誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE及Western blot觀察表達結(jié)果。結(jié)果 成功克隆了C2株賈第蟲SENP編碼區(qū)全長序列，生物信息學(xué)分析顯示C2株賈第蟲SENP蛋白序列與WB株相同，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，其催化活性區(qū)位于126-497aa，被一段插入序列分割成兩個部分；構(gòu)建了SENP催化活性區(qū)原核表達載體并在大腸桿菌中高效表達，在相對分子量約43 kD的位置出現(xiàn)目的蛋白條帶，與理論值相符。結(jié)論 成功克隆了賈第蟲SENP基因并原核表達了其催化活性區(qū)，為賈第蟲SENP蛋白功能的研究提供了基礎(chǔ)。

藍氏賈第鞭毛蟲；SUMO特異性蛋白酶；原核表達；生物信息學(xué)

小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)是一種與泛素結(jié)構(gòu)和作用方式類似的小分子蛋白，由大約100個氨基酸殘基組成，在真核生物中高度保守，廣泛存在于真菌、原生動物、后生動物和植物中。SUMO能夠通過酶促反應(yīng)共價結(jié)合到靶蛋白上，修飾調(diào)節(jié)靶蛋白的功能，這個過程被稱作SUMO化，是一種重要的翻譯后修飾機制，廣泛存在于所有的真核生物，其反應(yīng)過程和作用方式類似于泛素化。與泛素化導(dǎo)致蛋白降解的功能不同，蛋白的SUMO化修飾會產(chǎn)生多種不同的生物學(xué)效應(yīng)，參與包括胞質(zhì)/核物質(zhì)運輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡、調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、應(yīng)激反應(yīng)在內(nèi)的許多重要的生物學(xué)過程[1-4]。SUMO化是一個動態(tài)可逆的過程，SUMO化的蛋白可以被SUMO特異性蛋白酶(SUMO-specific protease，SENP)催化而脫去結(jié)合的SUMO蛋白，這個過程稱為去SUMO化。SENP屬于C48半胱氨酸蛋白酶家族，具有兩種功能，一方面能夠特異性剪切SUMO蛋白C末端的甘氨酸和底物賴氨酸之間的異肽鍵，使SUMO蛋白從底物上脫落下來，即去SUMO化作用；另一方面，SENP還參與SUMO前體蛋白的成熟過程繼而間接影響SUMO的結(jié)合。SENP存在于幾乎所有的真核生物中，提示SENP對于真核生物的生存具有非常關(guān)鍵的作用。

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia，簡稱賈第蟲)是一種常見的腸道寄生性原蟲，可以寄生在人和多種哺乳動物的小腸，引起以腹瀉、腹痛、吸收不良為主要表現(xiàn)的賈第蟲病。賈第蟲是最早分化出來的真核生物之一，被稱為“生物活化石”，在生物進化研究中處于重要地位[5]。賈第蟲SUMO化研究目前未見相關(guān)報道，在之前的研究中，我們證實了賈第蟲有單一種類的SUMO蛋白存在，且與其他物種SUMO蛋白在進化過程中距離較遠[6]。通過對GenBank檢索，我們發(fā)現(xiàn)WB株賈第蟲基因組中存在編碼SENP基因的可能序列，但未經(jīng)過實驗驗證。本研究在C2株賈第蟲中分離克隆SENP基因的同源基因，根據(jù)測序結(jié)果對SENP蛋白進行了生物信息學(xué)分析，并原核表達了其催化活性區(qū)，為賈第蟲SENP功能的研究提供了前提。

1 材料與方法

1.1 材料 C2株賈第蟲，大腸桿菌菌株EcoliDH5α、Rosetta(DE3)，原核表達質(zhì)粒pET-28a (+)均由本實驗室保存；引物合成及測序工作由上海生工生物技術(shù)有限公司完成；2×Pfu Master Mix購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ購自NEB公司；T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司；Taq DNA聚合酶、pGM-T連接試劑盒、血液基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒購自北京TIANGEN生化科技有限公司；鼠源抗His單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲體的培養(yǎng) 將液氮內(nèi)凍存的C2株賈第蟲復(fù)蘇。置含改良TYI-S-33培養(yǎng)基的硼酸硅培養(yǎng)管內(nèi)，于37 ℃培養(yǎng)。48～72 h后，蟲體即呈對數(shù)生長期。選取蟲體生長旺盛的培養(yǎng)管，置4 ℃冰浴，15 min后取出，在雙手掌間多次滾搓培養(yǎng)管，使貼壁生長的蟲體完全自管壁脫落。用血球計數(shù)板計數(shù)蟲數(shù)，再用培養(yǎng)基將蟲液濃度調(diào)為6×106～10×106個滋養(yǎng)體/mL。

1.2.2 C2株賈第蟲SENP編碼區(qū)的克隆 離心收集蟲體團塊，采用血液基因組提取試劑盒提取蟲體基因組DNA。根據(jù)GenBank中WB株賈第蟲SENP(XM_001705896.1)核酸序列設(shè)計擴增SENP全長編碼區(qū)的引物SENP-SN(5′-ATGACTGCTGAACTGTTGCAGC-3′)及SENP-ASN(5′- CTAGCAGAGCTCGTCCAGATC -3′)。以賈第蟲基因組DNA為模板，采用2×Pfu Master Mix擴增SENP全長編碼區(qū)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后向反應(yīng)體系中加入0.5 μL Taq DNA聚合酶，72 ℃延伸15 min加A尾。PCR產(chǎn)物中的目的帶經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物估濃度后與pGM-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化EcoliDH5α，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ單酶切鑒定正確后送測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將C2株賈第蟲SENP編碼區(qū)測序結(jié)果通過軟件翻譯成蛋白質(zhì)，應(yīng)用PSIPRED、PredictProtein、APSSP2、SOPMA等多個蛋白序列分析平臺在線分析該蛋白的二級結(jié)構(gòu)特征。采用PredictProtein、 Psort服務(wù)器預(yù)測賈第蟲SENP蛋白的亞細(xì)胞定位，PROSITE和InterPro服務(wù)器分析賈第蟲SENP蛋白的催化活性區(qū)域。采用Phyre2服務(wù)器同源建模預(yù)測賈第蟲SENP蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 C2株賈第蟲SENP催化區(qū)的克隆及原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)PROSITE和InterPro預(yù)測的SENP催化區(qū)設(shè)計引物SENPc-SN(5′-CATGCCATGGGGACTCTCAGTGGCGCC-3′)和SENPc-ASN(5′-CCGCTCGAGACGTGCAATCATCTTCATA-3′)，上下游引物分別含有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(下劃線部分)。以包含SENP全長序列的pGM-T-SENP為模板，擴增催化區(qū)編碼序列， PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物和pET-28a(+)載體同時用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的片段和線性載體并估濃度，以適當(dāng)比例混合進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化EcoliDH5α。通過卡那霉素(50 μg/mL)抗性平板篩選陽性克隆，挑菌擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定。

1.2.5 SENP催化活性區(qū)的誘導(dǎo)表達和鑒定 將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達菌株Rosetta(DE3)，涂卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)雙抗平板，挑取單菌落于含雙抗的LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮雙抗LB培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600 達到0.4～0.6時加入終濃度1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于30 ℃誘導(dǎo)表達5 h。煮沸裂解獲得全菌體蛋白，分別經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測融合蛋白表達情況。Western blot以抗His-Tag鼠源單克隆抗體(1∶1 000)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶2 000)為二抗， DAB顯色觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 C2株賈第蟲SENP全長編碼區(qū)的克隆 PCR產(chǎn)物電泳顯示，在大約1 620bp處出現(xiàn)特異性片段，與預(yù)期大小相符(圖1)；將目的片段連接到pGM-T載體后提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRI單酶切，電泳可見1 620 bp左右的SENP目的片段 及3 015 bp的pGM-T載體兩條電泳條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果顯示pGM-T-SENP克隆載體構(gòu)建成功。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR產(chǎn)物

2.2 C2株賈第蟲SENP蛋白的生物信息學(xué)分析 BLAST序列比對顯示C2株賈第蟲SENP編碼區(qū)序列與WB株完全相同。將賈第蟲SENP核苷酸序列通過Gene Runner軟件翻譯成蛋白，結(jié)果顯示賈第蟲SENP蛋白由539個氨基酸組成，分子量約59.7 kD。PSIPRED服務(wù)器預(yù)測SENP蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，占蛋白全長的66.98%；α螺旋結(jié)構(gòu)占蛋白全長的27.46%；β折疊鏈結(jié)構(gòu)占蛋白全長5.57%。這一結(jié)果與APSSP2、PredictProtein、SSpro4等服務(wù)器預(yù)測的結(jié)果大致相同。PredictProtein和Psort服務(wù)器預(yù)測該蛋白定位于核漿中。PROSITE和InterPro服務(wù)器預(yù)測該蛋白屬于C48半胱氨酸蛋白酶家族，其ULP蛋白酶催化活性區(qū)域位于126-497aa。該催化活性區(qū)域又被一段插入序列分為兩個關(guān)鍵的活性區(qū)段，即126-247aa和476-497aa。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pGM-T-SENP載體EcoRI單酶切產(chǎn)物

Phyre2服務(wù)器選取可信度(100%)和一致性(33%)最高，且具有對應(yīng)PDB 數(shù)據(jù)的d2iy1a1(腺病毒半胱氨酸蛋白酶Adenain)作為模版進行賈第蟲SENP蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，其模建殘基范圍在101-528aa，涵蓋了賈第蟲SENP的關(guān)鍵催化區(qū)域，基本能夠反映該蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.3 賈第蟲SENP催化區(qū)域原核表達載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物電泳顯示，在大約1 157 bp處出現(xiàn)特異性片段，與預(yù)期大小相符(圖4)；將目的片段連接到pET-28a(+)載體后提取質(zhì)粒經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切，電泳可見1 150 bp左右的SENPc目的片段及5 369 bp的載體pET-28a(+)兩條電泳條帶(圖5)，與預(yù)期結(jié)果一致，提示pET-28a(+)-SENPc表達載體構(gòu)建成功。

2.4 C2株賈第蟲SENPc融合蛋白的誘導(dǎo)表達和鑒定 菌液加入終濃度1.0 mmol/L IPTG，30 ℃誘導(dǎo)5 h后取少量菌液進行SDS-PAGE電泳，與未加IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)-SENPc轉(zhuǎn)化菌比較，在43 kD處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖6)。

圖3 Phyre2服務(wù)器由Adenain建模的賈第蟲SENP蛋白三維模型

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR產(chǎn)物

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-28a(+)-SENPc載體NcoI和XhoI雙酶切產(chǎn)物

Western blot結(jié)果顯示，在43 kD大小處出現(xiàn)一條陽性條帶(圖7)。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：IPTG誘導(dǎo)后的pET28a(+)-SENPc/Rosetta(DE3)全菌體裂解物；2：未經(jīng)誘導(dǎo)的pET28a(+)-SENPc/Rosetta(DE3)全菌體裂解物

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：IPTG誘導(dǎo)后的pET28a(+)-SENPc/Rosetta(DE3)全菌體裂解物；2：未經(jīng)誘導(dǎo)的pET28a(+)-SENPc/Rosetta(DE3)全菌體裂解物

3 討 論

SENP是SUMO化修飾中的關(guān)鍵酶，在SUMO化和去SUMO化過程中均發(fā)揮著重要的作用。在細(xì)胞內(nèi)，新合成的SUMO蛋白通常以無活性的前體形式存在，其C末端帶有一段約2～11氨基酸長短不等的短肽。SENP將其C末端短肽切除掉，暴露出保守的C端Gly-Gly模序，此時SUMO轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓墓δ艿鞍?，成熟的SUMO蛋白在E1活化酶、E2結(jié)合酶以及E3連接酶的催化下通過其C端最后一個Gly的羧基末端與靶蛋白Lys殘基上的ε氨基以異肽鍵結(jié)合。在去SUMO化過程中，SENP發(fā)揮異肽酶的作用，破壞Gly-Gly與靶蛋白Lys之間的異肽鍵，將靶蛋白釋放。SENP對于真核生物的生存是必需的，將酵母的SENP——U1p1(Ubiquitin-like specific protease 1)敲除后，酵母不能生存[7-8]。

釀酒酵母的Ulp1是第一個鑒定出來的SENP，通過序列比對分析，陸續(xù)鑒定出第二個酵母SENP——Ulp2以及其它各種生物的SENP。所有SENP都存在一個約200aa保守的ULP 結(jié)構(gòu)域，即催化結(jié)構(gòu)域，絕大部分位于C端，只占了SENP全蛋白的一小部分。而占蛋白全長大部分的N端非催化結(jié)構(gòu)域保守性很差，決定了該種SENP的亞細(xì)胞定位及其對底物的識別特異性。有研究顯示，SENP對SUMO分子和底物的識別主要依賴底物的空間結(jié)構(gòu)，而不像其他蛋白酶只識別特定的氨基酸序列[9]。多數(shù)真核生物都存在一種以上的SENP，例如酵母有2種SENP，在哺乳動物中目前已發(fā)現(xiàn)6 種SENP，而某些植物，例如擬南芥，存在多達7種SENP，其中一些SENP還存在剪接造成的異構(gòu)體，進一步加大了SENP家族的多樣性。但通過序列比對，我們發(fā)現(xiàn)賈第蟲僅存在此一段帶有ULP結(jié)構(gòu)域的同源蛋白，且同源性較低，這一結(jié)果進一步支持了賈第蟲在進化中的原始性。

雖然SUMO分子與泛素分子在空間結(jié)構(gòu)上非常相似，且SUMO化和泛素化是兩個程序和機制非常類似的修飾過程，SENP與去泛素蛋白酶的相似性卻很低，而與病毒蛋白酶具有很高的相似性[10]。因此，在賈第蟲SENP三級結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建上，選擇了相似性最高的腺病毒半胱氨酸蛋白酶Adenain作為模版。對賈第蟲SENP的催化活性區(qū)的分析顯示，賈第蟲SENP與哺乳動物的SENP6/7最為類似，其ULP催化活性區(qū)被一段插入序列分隔成了兩個部分[11]。其預(yù)測核漿內(nèi)定位的特點也類似于SENP6/7，但哺乳動物的SENP6/7主要作用SUMO2/3且沒有SUMO前體加工的能力[12]。賈第蟲SENP的亞細(xì)胞定位和酶活性仍需進一步實驗證實。

由于賈第蟲基因組具有缺乏內(nèi)含子的原始特性，在賈第蟲SENP編碼基因的克隆中，我們直接用C2株賈第蟲的基因組DNA取代cDNA作為模板，簡化了實驗操作的步驟。此外，鑒于賈第蟲SENP編碼序列中含有大量大腸桿菌的稀有密碼子，我們采用了攜帶稀有密碼子tRNA編碼質(zhì)粒的Rosetta(DE3)菌株，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率差別導(dǎo)致的表達限制。C2株賈第蟲SENP蛋白的克隆、生物信息學(xué)分析以及活性區(qū)的原核表達，證實了賈第蟲中該蛋白的存在，為賈第蟲SENP功能的研究提供了基礎(chǔ)。

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Cloning and bioinformatics analysis ofGiardialambliaC2 strain SENP gene and prokaryotic expression of SENP catalytic domain

LI Shao-dong,ZHOU Ying-bin,LIU Xiao-li,ZHU Han,LI Si-jin,TIAN Xi-feng,WANG Yang

(CollegeofLifeSciences,HebeiUnionUniversity,Tangshan063000,China)

SUMOylation is a post-translational modification involved in various cellular processes. SUMO-specific protease (SENP) regulates SUMOylation by removing SUMO from conjugated substrates (deSUMOylation) and promoting maturation of SUMO precursor. In order to expressGiardialambia(C2 strain) SENP catalytic domain inE.coli, the full-length open reading frame of SENP was amplified by PCR fromGiardialambliagenome DNA. The PCR product about 1 620 bp was cloned into cloning vector pGM-T. Sequencing result showed the sequence of SENP in C2 strain was identical with that inGiardiaWB strain. Bioinformatics analysis showed that SENP protein possessed a 372 aa discontinuous ULP catalytic domain at C-terminal. The catalytic domain of SENP was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+). The recombinant vector pET-28a(+)-SENPc was transformed intoE.coliRosetta(DE3), then the recombinant SENPc protein was expressed by IPTG induction. SDS-PAGE and Western blot using anti-His Tag antibody showed that the expression product of SENPc was a fusion protein with a molecular weight of 43 kD. The successful prokaryotic expression and bioinformatics analysis ofGiardialambliaSENP protein provide basis for further functional study of SENP.

Giardialamblia; SUMO-specific protease; prokaryotic expression; bioinformatics

Wang Yang, Email: konig718@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.003

國家自然科學(xué)基金(No. 31471954)和河北省青年科學(xué)基金(No.C2012401039)聯(lián)合資助

王洋，Email：konig718@163.com

河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，唐山 063000

R382.21

A

1002-2694(2015)03-0203-05

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31471954) and the Hebei Province Science Foundation for Youths (No. C2012401039)

2014-08-19；

2014-10-23