李 浩，赫曉霞，曹玉璽，聶 凱，劉 巖，何 英，高曉艷，付士紅，王環(huán)宇

Flanders病毒TaqMan RT-PCR檢測(cè)方法的建立

李 浩1，赫曉霞1，曹玉璽1，聶 凱1，劉 巖2，何 英1，高曉艷1，付士紅1，王環(huán)宇1

目的 應(yīng)用TaqMan PCR技術(shù)建立針對(duì)Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。方法 下載GenBank中FLAV基因序列資料并進(jìn)行多序列比對(duì)分析，選擇其L基因中的高保守序列片段進(jìn)行FLAV特異引物與探針的設(shè)計(jì)，使用來(lái)自于不同科屬的15株病毒驗(yàn)證方法特異性，通過(guò)重復(fù)/平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法穩(wěn)定性，并利用體外轉(zhuǎn)錄的L基因RNA標(biāo)準(zhǔn)品建立基因拷貝數(shù)絕對(duì)定量分析模型。結(jié)果 引物與探針工作特異性良好，同一樣品重復(fù)檢測(cè)Ct值的變異系數(shù)均小于1.7%，定量分析模型靈敏度達(dá)到100 copies/PCR。結(jié)論 建立完成針對(duì)FLAV的TaqMan PCR檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法具有高特異性、高敏感性、高穩(wěn)定性、簡(jiǎn)便、易操作的特點(diǎn)，為今后對(duì)FLAV的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)及相關(guān)研究提供技術(shù)手段。

Flanders病毒；TaqMan RT-PCR;分子檢測(cè)

Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，但目前還未進(jìn)行明確分類(lèi)[1]。FLAV是一種單股負(fù)鏈的RNA病毒，庫(kù)蚊是其最主要的傳播媒介，主要的宿主為野生鳥(niǎo)類(lèi)，其首次被發(fā)現(xiàn)于1961年，以發(fā)現(xiàn)地“Flanders”命名[2-4]?！癋landers”是位于美國(guó)紐約州的一個(gè)小村莊，因?yàn)閾碛邢鄬?duì)較長(zhǎng)的海岸線(xiàn)，成為蚊子理想的棲息地[2,5]。Flanders病毒的抗原反應(yīng)與Hart Park病毒(Hart Park virus，HPV)較為接近，但又有所不同[3]。目前人類(lèi)對(duì)FLAV感染人體后所造成的特異性臨床癥狀，還沒(méi)有確切的認(rèn)識(shí)。因此，人類(lèi)對(duì)該病毒感染和傳播的預(yù)警尤為困難。

雖然，我國(guó)目前尚未發(fā)現(xiàn)FLAV的感染與傳播，但隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和日益增多的國(guó)際交流與合作，一些國(guó)外其他地區(qū)流行的疾病與病原體傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)日益增高。根據(jù)美國(guó)經(jīng)驗(yàn)顯示，F(xiàn)LAV在其東部不少地方的蚊媒監(jiān)測(cè)中出現(xiàn)的頻率，要高于其它常見(jiàn)的致病性蟲(chóng)媒病毒，如西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)等。所以理論上，F(xiàn)LAV完全可以作為WNV等蟲(chóng)媒病毒哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)的對(duì)象，建立針對(duì)FLAV的監(jiān)測(cè)與檢測(cè)能力，可以有效提高我國(guó)對(duì)外來(lái)蟲(chóng)媒病毒病的發(fā)現(xiàn)和預(yù)警能力。本研究利用TaqMan PCR技術(shù)建立針對(duì)FLAV的Realtime PCR方法，具有高特異性、高敏感性、高穩(wěn)定性、簡(jiǎn)便、易操作的特點(diǎn)，為今后對(duì)FLAV的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)及相關(guān)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 引物、探針的設(shè)計(jì) 選擇GenBank發(fā)表的全部2株FLAV中L基因序列進(jìn)行全基因序列比對(duì)，根據(jù)TaqMan PCR引物、探針設(shè)計(jì)原則[6]，選擇最為保守的區(qū)域作為擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段。在此區(qū)域內(nèi)利用Primer Express 3.0輔助設(shè)計(jì)引物及探針序列，并通過(guò)Blast分析驗(yàn)證其廣譜性和特異性。引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，探針由上海生工生物工程有限公司合成并標(biāo)記，探針5′、3′端分別標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)和TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。

1.2 FLAV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的合成及體外轉(zhuǎn)錄 根據(jù)引物及探針位置，設(shè)計(jì)合成FLAV中L片段基因高度保守區(qū)域(4774-4849)作為檢測(cè)目標(biāo)片段，并克隆至PGEM-Teasy載體中，基因合成與質(zhì)?？寺∮杀本╄魑跎锟萍加邢薰就瓿?。對(duì)克隆質(zhì)粒中目標(biāo)片段進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行回收和純化(TaKaRa公司GoTaq Green Master Mix，QIAgen公司Gel Extraction Kit)，再通過(guò)紫外核酸蛋白定量?jī)x對(duì)回收的線(xiàn)性化DNA模板進(jìn)行定量，用RiboMAX Large Scale RNA Production System T7(Promega公司)進(jìn)行RNA體外轉(zhuǎn)錄并回收，回收的RNA通過(guò)紫外核酸蛋白定量?jī)x進(jìn)行定量，根據(jù)RNA序列的分子量進(jìn)行濃度換算。以上實(shí)驗(yàn)操作均按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.3 TaqMan PCR檢測(cè)體系的建立 通過(guò)優(yōu)化，建立體積為25 μL/管的TaqMan PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系組成：10 μmol/L的上下游引物與5 μmol/L的探針各1 μL，2×Reaction Buffer 12.5 μL和Enzyme Mix 1 μL(ABI公司，AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit)，RNA模板1 μL，剩余由DEPC水補(bǔ)齊。使用Mx3000P Real Time System(STRATAGENE公司)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：45 ℃反轉(zhuǎn)錄10 min，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。

1.4 檢測(cè)體系的特異性評(píng)價(jià) 利用本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的5科11種15株病毒的RNA與FLAV陽(yáng)性質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄的RNA為模擬樣本，進(jìn)行FLAV Taqman RT-PCR檢測(cè)體系的特異性驗(yàn)證。15株病毒信息如下：登革熱病毒血清1-4型各1株、西尼羅病毒1株、乙型腦炎病毒基因1型和3型各1株、蜱傳腦炎病毒1株、庫(kù)蚊黃病毒1株，彈狀病毒科狂犬病病毒1株，布尼亞病毒科Tahyna病毒1株、巴泰病毒1株，披膜病毒科甲病毒屬蓋塔病毒1株，呼腸孤病毒科版納病毒1株和遼寧病毒1株。

1.5 檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 使用RQ1 DNase對(duì)FLAV陽(yáng)性質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄所得RNA進(jìn)行消化，去除殘留DNA后，利用紫外核酸蛋白定量?jī)x對(duì)轉(zhuǎn)錄所得RNA進(jìn)行定量，按照公式(6.02 ×1023)×(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度ng/μL)/(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA分子量)=copies/μL計(jì)算RNA拷貝數(shù)。通過(guò)系列稀釋?zhuān)@得101～104copies/μL 的4個(gè)不同濃度梯度的樣品，進(jìn)行Taqman PCR擴(kuò)增與分析。根據(jù)不同濃度樣品拷貝數(shù)和循環(huán)閾值(Ct)的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.6 檢測(cè)體系穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 對(duì)所獲得的FLAV標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10-1～10-4梯度稀釋?zhuān)@得濃度分別為6×106～6×103copies/μL的4個(gè)不同濃度的RNA樣品，以此為模板進(jìn)行4次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)所獲得的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算每個(gè)樣品4次實(shí)驗(yàn)中Ct值的平均值(Mean)、標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)與變異系數(shù)(CV)，用以評(píng)價(jià)該檢測(cè)體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 FLAV特異的引物與探針 設(shè)計(jì)合成的FLAV特異性引物與探針序列信息見(jiàn)表1，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為74 bp。

2.2 檢測(cè)體系特異性 如圖1所示，僅有FLAV的RNA得到成功擴(kuò)增，其他毒株均無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)。

2.3 檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 獲得檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=-3.428×LOG(X)+41.25，R2=1.000。所建立方法最低檢測(cè)限(LOD)為：100 copies/PCR。見(jiàn)圖2。

2.4 檢測(cè)體系穩(wěn)定性 如表2所示， 各樣品平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差S均<0.5，變異系數(shù)CV均<1.7%，表明該檢測(cè)體系穩(wěn)定性良好。

表1 熒光定量PCR檢測(cè)FLAV的引物與探針序列信息

注：引物和探針在基因組中的核酸位點(diǎn)依據(jù)的是FLAV毒株 61-7484(GenBank號(hào)為AF523199)序列。

Note: All the primers and probe were designed based on the whole sequence of 61-7484 strain FLAV (GenBank Accession: AF523199).

注：1-4分別為登革熱病毒血清1-4型，5為西尼羅病毒，6-7分別為乙型腦炎病毒基因1型和3型，8為蜱傳腦炎病毒，9為庫(kù)蚊黃病毒，10為狂犬病病毒，11為T(mén)ahyna病毒，12為巴泰病毒，13為蓋塔病毒，14為版納病毒，15為遼寧病毒。

圖2 FLAV病毒基因拷貝數(shù)定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

3 討 論

FLAV全基因組自3′-5′端，依次排列著N、P、U1、U2、U3、M、G、SH和L片段[4]。其中N、P、M、G和L為結(jié)構(gòu)基因，分別編碼核蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、糖蛋白和L大蛋白。在GenBank中收錄的全部FLAV基因序列中，與結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)的寥寥無(wú)幾，其中最多的為L(zhǎng)基因序列，一共2條。本研究選擇了相對(duì)較為保守的L基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，鎖定L基因序列中最為保守的區(qū)域作為擴(kuò)增目標(biāo)片段。全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的針對(duì)FLAV L基因的一步法TaqMan RT-PCR檢測(cè)方法具有較高的特異性、穩(wěn)定性和敏感性，并可以達(dá)到最低100copies/PCR的檢測(cè)限值。

表2 FLAV檢測(cè)體系重復(fù)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

FLAV雖然已被人類(lèi)發(fā)現(xiàn)了50余年，但公開(kāi)發(fā)表的研究性論文卻極其有限，至今未能在彈狀病毒科內(nèi)明確分類(lèi)，且對(duì)人類(lèi)感染所造成的疾病和臨床癥狀均無(wú)明確記載。僅從現(xiàn)有資料可知，彈狀病毒科除去植物病毒外，引起動(dòng)物感染的病毒主要包括水泡性病毒屬、狂犬病病毒屬、短暫熱病毒屬和粒外彈狀病毒屬的病毒等。FLAV雖未歸至上述各病毒屬，但其感染復(fù)制特性具有本科病毒的普遍特征。從另一個(gè)角度來(lái)看，可能正是由于FLAV在人類(lèi)社會(huì)中感染造成的影響及危害相對(duì)有限，傳播地域也僅限于有報(bào)道的布局地區(qū)，所以未能得到更多的關(guān)注與研究。

FLAV在分離與鑒定時(shí)，若采用常規(guī)的分離培養(yǎng)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)標(biāo)本質(zhì)量要求較高，尤其對(duì)于病毒載量極低或無(wú)活病毒的標(biāo)本基本無(wú)效。本研究所建立的病毒檢測(cè)方法，是針對(duì)FLAV基因組RNA的一步法TaqMan PCR，可直接以FLAV基因組RNA為模板，提取后直接檢測(cè)并實(shí)時(shí)觀察結(jié)果，不僅耗時(shí)短，而且不易污染，相對(duì)傳統(tǒng)方法更加特異、敏感和定性，通過(guò)簡(jiǎn)便的操作就可以對(duì)FLAV進(jìn)行定性和定量。

TaqMan PCR技術(shù)是當(dāng)今應(yīng)用最為廣泛的Real-time PCR方法之一，相對(duì)其他的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法具有更高的特異性，其利用特異性熒光探針在PCR過(guò)程中所產(chǎn)生的熒光信號(hào)，動(dòng)態(tài)收集熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行定性和定量分析，具有檢測(cè)范圍廣、敏感度高、更為特異，且省時(shí)省力、無(wú)需電泳、減少污染等特點(diǎn)，適用于標(biāo)本量較大的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室篩查工作[7-9]。本研究建立的FLAV TaqMan PCR檢測(cè)方法，不僅可用于實(shí)驗(yàn)室的臨床診斷，還將為今后更加高效的開(kāi)展FLAV監(jiān)測(cè)及研究工作提供良好的技術(shù)支持。

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Establishment of TaqMan RT-PCR assay for Flanders virus

LI Hao1,HE Xiao-xia1,CAO Yu-xi1,NIE Kai1,LIU Yan2,HE Ying1,GAO Xiao-yan1,FU Shi-hong1,WANG Huan-yu1

(1.InstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChinaCDC,Beijing102206,China; 2.HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China)

The Flanders virus (FLAV) is a number of familyRhabdoviridae, contains a single-stranded, negative-sense viral RNA. Here we describe a molecular detection method developed for fast measurement of FLAV based on Taqman RT-PCR method. In this study, FLAV specific primers and probe were designed based on the FLAV L gene sequences published in GeneBank. Quantitative standard curve of FLAV TaqMan PCR was also successfully established. The specificity and stability test showed that the system is specific and the coefficient variables were all less than 1.7%. Quantitative standard curve based on the genomic copy was drawn, and the lowest detectable limit (LOD) of system was 100 copies/PCR, with higher sensitivity and stability than that of the conventional RT-PCR assay targeting the same gene.

Flanders virus; TaqMan RT-PCR; Molecular detection

Wang Huan-yu, Email:rainoffall@yahoo.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.005

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(No.2013ZX10004-101)(李浩、赫曉霞對(duì)本文同等貢獻(xiàn))

王環(huán)宇，Email：rainoffall@yahoo.com

1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206； 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，哈爾濱 150086

R373.9

A

1002-2694(2015)03-0212-04

Supported by the National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China (No. 2013ZX10004-101)

2014-10-23；

2014-11-27