白志軍，胡 林，李魁彪，鐘華燕，陳藝韻，魯恩潔，狄 飚

交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)甲型H1N1流感病毒及臨床應(yīng)用

白志軍1，胡 林2，李魁彪1，鐘華燕2，陳藝韻1，魯恩潔1，狄 飚1

目的 建立交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增(Cross Priming Amplification, CPA)技術(shù)對(duì)甲型H1N1流感病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法，并對(duì)該方法通過(guò)臨床標(biāo)本進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 根據(jù)甲型H1N1流感病毒的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，并在同一溫度下實(shí)現(xiàn)RNA的逆轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增，該擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)全封閉式核酸檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)。14份健康人咽拭子標(biāo)本、7個(gè)其他呼吸道病毒和6個(gè)蟲(chóng)媒病毒株被用來(lái)檢測(cè)CPA反應(yīng)的特異性；已知病毒滴度的甲型H1N1毒株進(jìn)行對(duì)照梯度稀釋，以測(cè)試CPA的敏感性；102份甲型H1N1臨床咽拭子標(biāo)本為檢測(cè)對(duì)象，評(píng)估其臨床的檢測(cè)的可行性。結(jié)果 CPA反應(yīng)未出現(xiàn)對(duì)健康樣本以及其他病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)；對(duì)已知滴度的病毒進(jìn)行梯度稀釋檢測(cè)，證明CPA的敏感性為10拷貝/μL 。對(duì)甲型H1N1流感臨床病例發(fā)病1～3 d臨床標(biāo)本新建檢測(cè)方法的檢出率為100%，4～6 d臨床標(biāo)本檢出率為79.31%，≥7 d臨床標(biāo)本檢出率為9.09%。討論 CPA具有較高的敏感性、特異性，對(duì)設(shè)備要求低，適合基層醫(yī)療單位對(duì)甲型H1N1流感發(fā)病早期診斷使用。

甲型H1N1流感病毒；交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；臨床應(yīng)用

2009年3月，甲型H1N1流感始于北美，迅速在全世界蔓延，中國(guó)大陸已經(jīng)普遍流行近年各地均有報(bào)告甲型H1N1 流感病例[1-2]。對(duì)于H1N1疫情防控策略的制定，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是比較有效的辦法。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)最快捷、有效的方法是熒光定量PCR，在但熒光定量PCR法需要價(jià)格昂貴的熒光定量PCR儀，檢測(cè)成本較高，且不易在基層醫(yī)院和防疫部門(mén)推廣，也不便于現(xiàn)場(chǎng)病原檢測(cè)的使用。因此，建立適合疫情現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)所需的，且不需特殊儀器的，費(fèi)用低廉的甲型H1N1流感病毒的核酸檢測(cè)技術(shù)就顯得尤為重要。本研究結(jié)合了交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Cross Priming Amplification, CPA)、核酸檢測(cè)試紙條技術(shù)和全封閉式核酸檢測(cè)裝置，建立了快速檢測(cè)甲型H1N1流感病毒特異性核酸的方法。使得RNA的逆轉(zhuǎn)錄以及DNA擴(kuò)增能在同一個(gè)溫度實(shí)現(xiàn)，而擴(kuò)增后的核酸產(chǎn)物可以用一個(gè)含有核酸試紙條的全封閉式核酸檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及其診斷標(biāo)準(zhǔn) 2009年8月至2010年9月廣州市疾病預(yù)防控制中心收集甲型H1N1流感病毒疑似感染患者咽拭子標(biāo)本102份和健康人咽拭子標(biāo)本14份，以及實(shí)驗(yàn)室保存的甲型流感病毒H3亞型、副流感病毒、禽流感H7N9亞型病毒、乙型流感病毒BV、BY亞型病毒和腺病毒等其他7株呼吸道病毒。廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心保存并提供西尼羅病毒、流行性乙型腦炎(乙腦)病毒、黃熱病毒；西門(mén)利克病毒、基孔肯雅病毒和辛德畢斯病毒等6株蟲(chóng)媒病毒；所有咽拭子標(biāo)本按照《WS285-2008流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行常規(guī)處理后，均接種MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，并用中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家流感中心提供的鑒定血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，鑒定其型別與亞型。經(jīng)鑒定甲型H1N1流感疑似標(biāo)本均為陽(yáng)性，健康人標(biāo)本均為陰性。

1.2 主要試劑和儀器 Bst DNA聚合酶購(gòu)自NEB公司、反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自杭州博日科技有限公司、病毒核酸提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，含有核酸試紙條的全封閉式核酸檢測(cè)裝置由杭州尤思達(dá)生物技術(shù)有限公司提供[3]。

1.3 CPA檢測(cè)

1.3.1 病毒核酸提取 使用病毒核酸提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)程序從140 μL標(biāo)本和病毒液中提取50 μL RNA并于-80 ℃保存。

1.3.2 CPA引物的設(shè)計(jì)及反應(yīng)原理 CPA擴(kuò)增主要包含以下幾個(gè)步驟，如圖1所示：

①交叉正向引物CPF中的PFs與模板DNA中PFa互補(bǔ)，啟動(dòng)DNA合成，使得PRa被引入到所擴(kuò)增的產(chǎn)物中；

②外圍引物DP1s與PFa前端DP1a序列互補(bǔ)，通過(guò)鏈置換型DNA聚合酶向前延伸，一邊置換CPF合成的能與CPR和DP2a結(jié)合的單鏈產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)3)，一邊與模板DNA形成雙鏈產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)2)；

③在結(jié)構(gòu)3中，DP2a通過(guò)鏈置換型DNA聚合酶向前延伸，置換出由CPR所延伸的單鏈產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)5)，同時(shí)合成與步驟2中由CPF延伸所產(chǎn)生單鏈DNA形成雙鏈產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)4)；

④單鏈結(jié)構(gòu)5中的3′端的PFa和PRs可分別與CPF中的PFs和CPR中的PRa互補(bǔ)結(jié)合， 可在鏈置換型DNA聚合酶的作用下延伸和置換出相應(yīng)的單鏈產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)8)；

⑤擴(kuò)增引物CPF和CPR的不斷雜交和延伸；，DNA拷貝數(shù)不斷的增加，從而達(dá)到基因擴(kuò)增的效果。

1.3.3 CPA反應(yīng)體系 針對(duì)甲型H1N1流感病毒的HA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，其中兩條特異性檢測(cè)探針?lè)謩e帶有生物素標(biāo)記和熒光素標(biāo)記，引物見(jiàn)表1。CPA反應(yīng)體積為20 μL，其中包括正向外圍引物0.3 μmol/L，反向外圍引物0.1 μmol/L，正向交叉引物2.0 μmol/L，反向交叉引物0.6 μmol/L，檢測(cè)探針各0.6 μmol/L；0.4 mmol/L dNTP；12U Bst酶 DNA聚合酶，2U反轉(zhuǎn)錄酶和4 μL RNA核酸模板。恒溫反應(yīng)溫度為60 ℃,90 min。

1.4 CPA結(jié)果判定 CPA反應(yīng)結(jié)束后，按照含核酸試紙條的全封閉式核酸檢測(cè)裝置的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作[4-5]。室溫靜止15～30 min，當(dāng)檢測(cè)裝置中的核酸免疫試紙條在檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)顯示兩條紅色條帶，結(jié)果為陽(yáng)性；檢測(cè)區(qū)沒(méi)有紅色條帶而質(zhì)控區(qū)顯示紅色條帶，結(jié)果為陰性。

2 結(jié) 果

2.1 CPA的敏感性 CPA 反應(yīng)分別對(duì)病毒滴度為2.25 × 107PFU /mL的H1N1病毒分離培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋檢測(cè)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次試驗(yàn)，結(jié)果顯示檢測(cè)敏感度為10拷貝/μL。

圖1 交叉引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)原理

2.2 CPA的特異性 CPA反應(yīng)對(duì)甲型流感病毒H3亞型、副流感病毒、禽流感H7N9亞型病毒、乙型流感病毒BV、BY亞型病毒、腺病毒、西尼羅病毒、流行性乙型腦炎(乙腦)病毒、黃熱病毒、西門(mén)利克病毒、基孔肯雅病毒和辛德畢斯病毒等13種病毒的檢驗(yàn)沒(méi)有交叉反應(yīng)，結(jié)果為陰性。14份健康人標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陰性。

2.3 CPA對(duì)臨床標(biāo)本的診斷 將以上CPA法檢測(cè)完成的102份陽(yáng)性H1N1患者臨床標(biāo)本，均通過(guò)MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離成功。細(xì)胞分離陽(yáng)性率為100%，以細(xì)胞分離法為標(biāo)準(zhǔn)，CPA法的檢出率為84.3%(86/102)，按照發(fā)病后不同采集時(shí)間進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?？梢?jiàn)發(fā)病1～3 d CPA法檢出率為100%(62/62)；4～6 dCPA法檢出率為79.31%(23/29)，漏檢率為20.69%(6/29)；≥7 d CPA法檢出率為9.09%(1/11)，漏檢率為90.9%(10/11)，數(shù)據(jù)經(jīng)χ2檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 檢測(cè)甲型H1N1流感病毒CPA系統(tǒng)的引物序列

表2 CPA方法和MDCK細(xì)胞分離病毒方法檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

甲型H1N1流感自2009年到現(xiàn)在流行期間，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)出現(xiàn)了許多針對(duì)新甲型H1N1流感不同的快速檢測(cè)方法，主要是熒光定量PCR法和膠體金免疫層析法[6-11]。由于熒光定量PCR法需要價(jià)格昂貴的熒光定量PCR儀，檢測(cè)成本較高，不易在基層醫(yī)院和防疫部門(mén)推廣，也不便于現(xiàn)場(chǎng)病原檢測(cè)的使用。膠體金免疫層析法檢測(cè)的敏感性仍有一定的局限性。

CPA是一種新型的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能對(duì)基因在60℃的條件下同時(shí)實(shí)現(xiàn)RNA的逆轉(zhuǎn)錄以及DNA的擴(kuò)增，而通過(guò)恒溫?cái)U(kuò)增得到的產(chǎn)物可以利用含核酸試紙條的全封閉式核酸檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)并降低擴(kuò)增物的交叉污染[12]。目前，CPA已經(jīng)成功的運(yùn)用到細(xì)菌和病毒的核酸檢測(cè)當(dāng)中，如結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)和新布尼亞病毒(novelbunyavirus)，并且已經(jīng)被證明具有高度的特異性和敏感性[13-15]。在本研究中，我們通過(guò)對(duì)CPA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合建立了一整套檢測(cè)甲型H1N1流感病毒的技術(shù)。

通過(guò)對(duì)已知濃度的H1N1病毒株進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，CPA的檢測(cè)下限為10拷貝/μL。CPA對(duì)7株呼吸道癥候群病毒和6株蟲(chóng)媒病毒的檢測(cè)結(jié)果，證明了其具有較高的特異性。雖然本研究以細(xì)胞分離法為標(biāo)準(zhǔn)，CPA法的檢出率僅為84.3%(86/102)，但如果我們對(duì)不同發(fā)病時(shí)段采集的臨床標(biāo)本檢測(cè)數(shù)據(jù)分析顯示，CPA方法對(duì)發(fā)病后1～3 d的咽拭子標(biāo)本陽(yáng)性檢出率最高為100%；隨后4～6 d和7 d以后的的標(biāo)本檢出率逐漸下降。咽拭子標(biāo)本中抗原檢出情況完全符合機(jī)體對(duì)病原免疫應(yīng)答的規(guī)律，在發(fā)病1～3 d因?yàn)闄C(jī)體免疫系統(tǒng)還未大量產(chǎn)生可中和病毒的抗體，故CPA檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率較高；發(fā)病4 d后，機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgM和IgG逐漸發(fā)生中和作用，降低了血清中的病毒載量，故CPA法陽(yáng)性檢出率逐漸下降。在本項(xiàng)研究發(fā)病后1～3 d標(biāo)本檢測(cè)數(shù)據(jù)中，CPA方法和病毒細(xì)胞分離2種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果之間一致性較好，可見(jiàn)CPA適合于甲型H1N1流感臨床發(fā)病早期的診斷。

CPA在實(shí)際操作還是在儀器要求方面，都比傳統(tǒng)的RT-PCR或者real-time RT-PCR技術(shù)更為簡(jiǎn)單。同時(shí)利用全封閉式核酸檢測(cè)裝置，不僅避免了靶核酸擴(kuò)增物釋放到空氣中形成污染，同時(shí)還可通過(guò)顯色判讀結(jié)果，降低了對(duì)操作人員的要求。利用CPA檢測(cè)甲型H1N1流感具有高較好的特異性和靈敏性，適用疾病防控的第一防線基層哨點(diǎn)部門(mén)或現(xiàn)場(chǎng)工作中，因此CPA 技術(shù)更具備廣泛的應(yīng)用前景。此次我們對(duì)CPA技術(shù)在甲型H1N1流感檢測(cè)中的應(yīng)用和評(píng)估，也為今后該技術(shù)的推廣利用積累了實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，將會(huì)在疾病的早期診斷及預(yù)防控制方面發(fā)揮重要作用。

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Establishment of cross priming amplification for influenza A virus (H1N1) and its clinical application

BAI Zhi-jun1,HU Lin2,LI Kui-biao1,ZHONG Hua-yan2,CHEN Yi-yun1,LU En-jie1,DI Biao1

(1.GuangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Guangzhou510440,China; 2.UstarBiotechnologies(Hangzhou)Co.,Ltd.,Hangzhou310012,China)

In this study, we established Cross Priming Amplification (CPA) technology for detection of influenza A virus (H1N1) approach, and evaluated the method through clinical specimens. A set of specific primers were designed for CPA according to the conservative gene sequences, designed and realized in the same temperature reverse transcription of RNA and DNA amplification. The amplification products can be totally enclosed nucleic acid detection device for testing. Fourteen healthy pharyngeal swab specimens, seven other respiratory viruses, and six arboviruses strains were used as the controls. We used a method that application of gradient dilution to the H1N1 virus strain as the control to test the sensitivity of the CPA. We also used 102 clinical pharyngeal swab specimens of H1N1 patients for detection object to evaluate the feasibility of CPA clinical detection. Results showed that the CPA reaction did not appear cross reaction on health cases samples and other viruses. The sensitivity of the CPA was approximately 10 copies/uL in the established method that exactly titer H1N1 virus strain gradient dilution test. As to the positive results among the clinical pharyngeal swab samples collected from patients at different stages after onset, the CPA had the highest positive detection rate during the first three days after onset (100%). While the detection rate from day 4 to day 6 after onset was 79.31%. After 7 days, the detection rate was 9.09%. The established CPA assay was a highly sensitive, specific and reproducible approach for rapid detection of H1N1 virus, which is conducive to the early diagnosis of influenza A virus (H1N1) for basic medical units.

influenza A virus(H1N1); cross priming amplification (CPA); clinical application

Di Biao, Email: biao65di@yahoo.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.004

國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10004-213-005)，廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(20131A011115，201102A212006)，廣州市科技和信息化局項(xiàng)目(2012Y2-00020)，廣東省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(2012B040304002)，廣州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2013-2015-07)聯(lián)合資助

狄飚，Email: biao65di@yahoo.com

1.廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣州 510440 2.杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，杭州 310012

R373.1

A

1002-2694(2015)03-0208-04

2014-06-24；

2014-11-30

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