邱笛 李勁頻 莫雪安 陳澤志 杜偉偉 劉競麗

全身型重癥肌無力患者異常胸腺microRNA表達譜的初步研究

邱笛 李勁頻 莫雪安 陳澤志 杜偉偉 劉競麗

目的 比較全身型重癥肌無力(generalized myasthenia gravis，GMG)患者異常胸腺(胸腺瘤、胸腺增生)與正常胸腺microRNA(miRNA)表達譜的差異，以探討胸腺miRNA在重癥肌無力發(fā)病機制中的作用。方法 應用RiboArrayTMmiRNA芯片檢測技術分別比較GMG伴胸腺瘤(4例)、胸腺增生(4例)患者胸腺與正常對照(4例)胸腺miRNA表達譜的差異，并利用生物信息學預測可能受其調控的靶基因。結果 GMG胸腺瘤組、GMG胸腺增生組與正常對照組之間胸腺miRNA聚類分析樹狀圖差異明顯；GMG胸腺瘤組較正常對照組顯著差異表達的胸腺miRNA共有16個，其中14個下調，下調最顯著的為hsa-miR-362-3p，2個上調，上調最顯著的為hsa-miR-125a-5p；GMG胸腺增生組較正常對照組顯著差異表達的miRNA共有38個，其中下調者37個，下調最顯著的為hsa-miR-548av-3p，上調者1個，為hsa-miR-4442。結論 異常表達的胸腺miRNA可能在重癥肌無力發(fā)病中起作用。

重癥肌無力；胸腺瘤；胸腺增生；微RNAs；芯片分析技術；基因表達譜

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種主要累及神經肌肉接頭突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)的自身免疫性疾病[1]。至今其發(fā)病機制尚未完全闡明。較多研究結果提示胸腺免疫功能異?？赡芘cMG的發(fā)生有關，然而其具體途徑尚未闡明[2]。MicroRNA(miRNA)是一類新型保守的小分子單鏈非編碼RNA，通過堿基互補結合到靶目標mRNA上，抑制mRNA的翻譯或者降解mRNA，從而在轉錄后水平調控基因表達。據推測，人類基因組30%以上的基因受miRNA調控，其功能涉及細胞的增殖、成熟、分化、凋亡等生命過程，與免疫調節(jié)密切相關。研究發(fā)現miR-181a通過靶向Bcl2、CD69、T細胞抗原受體(TCR)參與胸腺中T細胞的調節(jié)過程，而miR-155通過靶向巨噬細胞活化因子(MAF)參與調節(jié)胸腺生發(fā)中心B細胞反應[3]。miRNA不僅參與機體的免疫調節(jié)，而且其表達異常還與自身免疫性疾病密切相關，已有報道顯示miR-125a在系統(tǒng)紅斑狼瘡(SLE)中通過靶向腸道內富含的Kruppel樣因子13(KLF13)導致SLE惡化[4]。最近研究結果顯示MG患者外周血中異常表達的miRNA可能在其發(fā)病機制中起一定作用[5]。然而，目前尚未檢索到關于胸腺miRNA在MG發(fā)生、發(fā)展中作用的研究。本研究運用RiboArrayTMmiRNA基因芯片檢測技術，比較全身型重癥肌無力(generalized MG，GMG)伴發(fā)胸腺瘤、胸腺增生患者與正常對照者胸腺miRNA表達譜的差異，并預測其靶基因，旨在探討胸腺miRNA在GMG發(fā)病機制中的調控作用。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2012-03-2013-03廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科住院確診為GMG伴發(fā)胸腺瘤或胸腺增生并行胸腺切除術的患者和無自身免疫性疾病的先天性心臟病(ASD)行開胸切除正常胸腺的患者共12例，取12份胸腺標本，其胸腺標本的病理診斷由病理科完成。(1)正常對照組4份，取自4例ASD患者〔男女各2例，平均年齡(39.0±6.1)歲〕正常胸腺組織；(2)GMG胸腺瘤組4份，取自GMG伴胸腺瘤患者〔男女各2例，平均年齡(41.0±10.1)歲，平均病程(10.0±2.3)年〕的胸腺瘤旁臨近胸腺組織；(3)GMG胸腺增生組4份，取自GMG伴發(fā)胸腺增生患者〔男女各2例，平均年齡(36.0±7.3)歲，平均病程(5.0±3.0)年〕的胸腺增生旁臨近胸腺組織。各組間患者年齡、性別構成比較無統(tǒng)計學差異。所取標本經生理鹽水漂洗后立即裝入凍存管放入液氮罐速凍，后轉入-80℃低溫冰箱待用。所有患者手術前均停止藥物治療至少1個月。本研究通過廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院研究倫理委員會的批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 包括Trizol裂解液(美國Invitrogen生命技術公司)、miRNA(v.18.0)基因芯片(廣州市銳博生物科技有限公司)、GenepixPro7.0圖像分析軟件(美國Axon Instruments公司)、Genepix 4000B激光掃描儀(美國Axon Instruments公司)。

1.3 方法

1.3.1 胸腺組織總RNA提取及質量檢測：按照RNA試劑盒說明書實驗步驟，Trizol法提取胸腺標本總RNA，并檢測RNA濃度，結果以吸光度〔D(λ)〕值表示，隨后行RNA甲醛變性凝膠電泳鑒定RNA質量，-70°C保存。

1.3.2 miRNA芯片檢測及分析：根據總RNA的起始量選擇相應的稀釋比例, 依據說明書制備poly(A)Tailing Mix；進行生物素標記miRNA；取出芯片將其平衡至室溫，雜交液加入到標記好的miRNA體系中，將100 μL雜交液注入至芯片中，將芯片平衡放置于雜交爐中，48℃，60 r/min旋轉雜交16 h。雜交完成后進行芯片清洗染色，使用Genepix 4000B激光掃描儀進行圖像采集，使用Genepix Pro 7.0圖像分析軟件對掃描后的圖像進行背景抽離和歸一化，得到標準化的數據。然后計算每個miRNA在組間差異表達的2-Foldchange值及P值。根據此標準可篩選得到各組間差異表達的miRNA。采用Cluster3.0分析軟件對差異表達的miRNA進行聚類分析，并采用SAM軟件統(tǒng)計分析獲得顯著差異表達的miRNA。由廣州銳博有限公司提供技術平臺。為保證結果的可靠性，所有送檢標本均未標注樣品組別，僅標注標本序號。

1.3.3 靶基因預測：運用miRecords(http://mirecords.biolead.org/)軟件預測靶基因。miRecords是一種整合型數據庫，對不同的數據庫間的靶基因預測進行比較、整合，是較好的預測軟件之一。

1.4 統(tǒng)計學處理 芯片數據統(tǒng)計學分析應用SAM&R軟件；芯片聚類分析應用Cluster3.0軟件，均由廣州銳博有限公司完成。差異表達的標準設為：上調者其2-Fold change值>1，下調者其2-Fold change值<-1，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胸腺組織總RNA質量檢測 樣品總RNA經甲醛變性凝膠電泳結果顯示，28S和18S電泳條帶清晰，28S條帶亮度約為18S條帶亮度的2倍，表明RNA完整性好、無降解(圖1)。其D(λ)260 nm/D(λ)280 nm>1.8，D(λ)260 nm/D(λ)230 nm>1.5，證實提取的總RNA完整性好、純度高。

2.2 芯片檢測結果 采用Cluster3.0分析軟件對差異表達的miRNA進行聚類分析的結果見圖2。GMG胸腺瘤組與正常對照組比較有顯著差異表達的miRNA共16個(表1)，其中14個下調，下調最顯著的為hsa-miR-362-3p，2個上調，上調最顯著的為hsa-miR-125a-5p；GMG胸腺增生組與正常對照組比較有顯著差異表達的miRNA共38個(表2)，下調者有37個，下調最顯著的為hsa-miR-548av-3p，上調者1個，為hsa-miR-4442。將GMG胸腺瘤組、GMG胸腺增生組中的miRNA表達譜進行對比，發(fā)現GMG胸腺瘤組與GMG胸腺增生組變化趨勢一致的miRNA共有10個(表1、2)，其中9個miRNA下調，下調最顯著的為GMG胸腺增生組的has-miR-570-5p和GMG胸腺瘤組的has-miR-362-3p，1個miRNA上調(hsa-miR-4442)。

1：正常對照組；2：GMG胸腺瘤組；3：GMG胸腺增生組

圖1 甲醛變性膠電凝泳檢測各組胸腺組織總RNA完整性

1：正常對照組；2：GMG胸腺瘤組；3：GMG胸腺增生組標本；圖中紅色代表miRNA上調，綠色代表miRNA下調；右上角小圖為色鍵圖，不同顏色梯度代表不同的表達量

圖2 各組胸腺miRNA聚類分析樹狀圖

表 1 GMG患者胸腺瘤組與正常對照組顯著差異表達的miRNA

注：a為log2為底轉化的標準化信號值之間的比值，表示miRNA表達水平在兩組之間的差異，當2-Fold change >1.0或2-Fold change<-1.0時認為miRNA表達有明顯差異；b 表示GMG胸腺瘤組與GMG胸腺增生組變化趨勢一致的miRNA。表2同

表 2 GMG患者胸腺增生組與正常對照組顯著差異表達的miRNA

2.3 靶基因預測結果 利用miRecords靶基因預測軟件，對各組最顯著差異表達的miRNA進行靶基因預測。分別對hsa-miR-362-3p，hsa-miR-125a-5p，hsa-miR-548av-3p，hsa-miR-4442，has-miR-570-5p進行靶基因預測發(fā)現，其中hsa-miR-362-3p、hsa-miR-125a-5p預測到靶基因(表3、4)。

表 3 Hsa-miR-362-3p可能的部分靶基因

表 4 Hsa-miR-125a-5p可能的部分靶基因

3 討論

近年來研究發(fā)現，miRNA在MG的發(fā)病機制中起重要作用。Cheng等[5]發(fā)現，miR-320a在MG患者外周血單核細胞(PBMC)中表達量明顯下降，它通過直接作用于目標蛋白絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)參與調節(jié)促炎細胞因子白細胞介素2(IL-2)、干擾素γ(IFN-γ)、IL-6 和IL-17的表達。Jiang等[6]研究發(fā)現，MG患者PBMC中有21個miRNA表達升高顯著，23個miRNA下降明顯，其中miR-let-7c下降顯著，它主要作用于IL-10 mRNA的3′端非編碼區(qū)，負調控IL-10的表達。

本實驗運用RiboArrayTMmiRNA芯片技術對GMG胸腺瘤組和GMG胸腺增生組患者胸腺miRNA的表達譜與對照組進行了比較發(fā)現，GMG患者胸腺miRNA表達譜與對照組相比有顯著差異，通過聚類分析樹狀圖進行區(qū)分發(fā)現，共有16個與GMG胸腺瘤相關的miRNA，其中有14個表達下調，2個表達上調，提示這16個miRNA可能與伴胸腺瘤GMG的發(fā)病機制有關。GMG胸腺增生相關的miRNA有38個，其中37個表達下調，1個表達上調，提示這些miRNA可能參與伴胸腺增生GMG的發(fā)病過程。這16個與GMG胸腺瘤相關的miRNA及38個與GMG胸腺增生相關的miRNA中，有哪些與胸腺瘤或胸腺增生的發(fā)生確切相關，哪些與MG的發(fā)病過程有關，尚需后期繼續(xù)深入研究。本研究發(fā)現GMG胸腺瘤組與GMG胸腺增生組存在10個變化趨勢一致的miRNA，推測這10個miRNA與GMG發(fā)病相關的可能性更大，提示胸腺瘤與胸腺增生并發(fā)GMG有部分相同的發(fā)病機制。最近Jiang等通過對比3名MG患者與3名正常人PBMC中miRNA的表達，顯示MG患者PBMC中共有21個miRNA明顯上調，23個miRNA下調[6]，但這44個miRNA中并不包括本實驗所檢測到的有明顯差異表達的miRNA。這種現象的產生可能由2個原因導致：(1)由于miRNA具有組織特異性，在胸腺組織細胞種類和數目不同于PBMC，所以會出現不同的miRNA；(2)胸腺是中樞免疫器官，因此在胸腺中檢測出的miRNA可能與中樞免疫調節(jié)異常有關，而外周血中的miRNA則可能與機體執(zhí)行外周免疫應答相關，所以在胸腺中和外周血中檢測到的miRNA種類不同。

本研究采用miRecords軟件對在實驗組中表達差異最顯著的miRNA靶基因進行預測發(fā)現，hsa-miR-362-3p和hsa-miR-125a-5p能夠預測出靶基因。然而hsa-miR-362-3p和hsa-miR-125a-5p靶基因較多，而且這些靶基因的生物學功能包括細胞周期調控、轉錄調控、免疫調控、信號通路的調控以及細胞的增殖、凋亡、分化等各個方面。已有研究表明，miR-362-3p通過靶向E2F1、USF2和PTPN1基因誘導細胞周期阻滯，從而在大腸癌的復發(fā)過程中起作用[7]。此外，miR-362-3p在炎性反應性腸病中異常表達，提示miR-362-3p可能參與其發(fā)病過程[8]。在單核細胞向巨噬細胞分化的過程中細胞內miR-125a-5p的表達下降，表明miR-125a-5p可能與巨噬細胞的分化有關[9]。那他珠單抗治療多發(fā)性硬化患者6個月后血液中miR-125a-5p的表達下降，表明miR-125a-5p可以在那他珠單抗治療多發(fā)性硬化過程中作為一種可能的評價療效的指標[10]。這些研究提示miR-362-3p及miR-125a-5p可能與機體免疫調控有關。需要注意的是，本文預測的靶基因僅為預測軟件所得，受其算法的影響預測數目太多，容易產生假陽性。最終確定miRNA的靶基因以及其對靶基因功能影響仍然需要用體外及體內的實驗方法來驗證[11]。

綜上所述，本研究通過miRNA芯片技術檢測，發(fā)現 GMG患者胸腺組織中有特異表達的miRNA存在，推測這些miRNA的功能可能與自身免疫耐受有關。然而本研究的實驗樣本例數較少，需進一步擴大樣本量驗證。深入研究這些特異改變的miRNA及其靶基因可為探索GMG的發(fā)病機制提供線索。

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(本文編輯：時秋寬)

Preliminary study of microRNA expression profiles in the abnormal thymus of generalized myasthenia gravis

QIUDi,LIJinpin*,MOXuean*,CHENZezhi,DUWeiwei,LIUJingli.

*DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,NanningGuangxi530021,China

LI Jinpin, Email:lijinpin009@163.com；MO Xuean, Email: mxa550@126.com

Objective To compare the expression of miRNAs between the abnormal thymus of generalized myasthenia gravis(GMG) and normal thymus tissue, and to develop primary understanding of the pathogenesis of GMG. Methods We investigated 8 thymus(4 thymomas and 4 thymic hyperplasias) of myasthenia gravis samples to examine miRNA expression profiles through miRNA microarray compared to 4 normal thymus. We also predicted the possible targets of miRNA by bioinformatics. Results The miRNA microarray chip analysis identified 16 miRNAs differentially expressed in thymomas of GMG compared with the health control group, 14 miRNAs were down-regulated and 2 up-regulated. In comparison between thymic hyperplasias GMG and the health control groups, 37 miRNAs are down-regulated, while 1 miRNA are up-regulated in the hyperplastic GMG group. Conclusions There is a specific miRNA profile in abnormal thymus(thymomas and thymic hyperplasia) of GMG comparing to normal thymus tissue. MiRNA might play an important role in the pathogenesis of GMG.

myasthenia gravis; thymoma; thymus hyperplasia; microRNAs; microchip analytical procedures; gene expression profiling

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.005

廣西自然科學基金項目資助項目(2014GXNSFAA118262)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研資助項目(Z2007084、Z2011047)

530021 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經內科

李勁頻，Email:lijinpin009@163.com；莫雪安，Email: mxa550@126.com

R746.1

A

1006-2963 (2015)03-0171-07

2015-01-29)