陳谷 雷海金 王宏 陳聰聰 向佳佳 張少波

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

復合酶漱口液消減牙菌斑的效果分析*

陳谷 雷海金 王宏 陳聰聰 向佳佳 張少波

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

齲齒的發(fā)生與牙齒表面附著的牙菌斑和細菌的作用密切相關(guān)，文中旨在通過復合酶液降解葡聚糖和淀粉類物質(zhì)來消除牙菌斑的存在基礎(chǔ)，考察去除牙菌斑的效果.實驗通過測定20名志愿者使用含不同濃度的復合酶漱口液、不含酶漱口液(無酶對照組)及市售精油類漱口液前后的Tureskey改良的Q-H菌斑指數(shù)的改變情況，考察β-葡聚糖酶和α-淀粉酶復合酶漱口液降解牙菌斑的效果.統(tǒng)計學結(jié)果顯示含酶量大于0.5mg/L時，牙菌斑降低率顯著優(yōu)于無酶對照組;且含酶量大于5.0mg/L時，牙菌斑降低率優(yōu)于某市售精油類漱口液.結(jié)果表明含酶漱口液對抑制牙菌斑的作用效果明顯.文中研究為齲齒的日常防治提供了理論依據(jù).

牙菌斑;Q-H菌斑指數(shù);復合酶漱口液;β-葡聚糖酶;α-淀粉酶

齲齒是口腔的常見病和多發(fā)病，盡管科技發(fā)展、各種口腔護理用品廣泛推廣和應用，齲齒仍然是造成不同年齡階段人群咀嚼困難的主要原因.人體口腔中有各種各樣的細菌菌群，是一個復雜的細菌“社區(qū)”［1-6］.其中的致齲菌群與非致齲菌群相比有獨特的特征，如:①對牙齒表面有較強的定植粘附能力;②具有較強的產(chǎn)酸性和耐酸性;③能分泌葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成胞外多糖，易形成生物膜－牙菌斑［6-7］.目前，口腔中的主要致齲菌群有3大類，即鏈球菌屬、乳桿菌屬、放線菌屬.研究表明，變形鏈球菌為革蘭氏染色陽性的一種球菌，是人體口腔天然菌群中所占比例最大的鏈球菌屬中的一種.變形鏈球菌生長在含蔗糖的培養(yǎng)基中，可產(chǎn)生大量的高分子質(zhì)量物質(zhì)——非水溶性葡聚糖，并同時觀察到變形鏈球菌的富集現(xiàn)象.葡聚糖作為一種粘性的膠體物質(zhì)，提供細菌聚集的場所，而變形鏈球菌具有一種表面受體，可將葡聚糖分子束縛在一起，在牙齒上形成菌斑［8］.牙菌斑是齲齒和牙周病重要的致病因素之一，抑制牙菌斑的發(fā)生和發(fā)展對于預防控制齲齒和牙周病至關(guān)重要.刷牙是維護口腔健康的主要方式，但是存在一定的局限性.常規(guī)刷牙只能清除牙面上40%～50%的菌斑，即使經(jīng)過專業(yè)的指導，也只能清除70%左右的菌斑，而對于牙齒鄰面和口腔其他部位的菌斑僅能清除少量或無法清除［9］，因此漱口液成為一種有效的輔助方法.目前常用的漱口液為冼必泰類和精油類漱口液，它們通過抑制微生物的生長和酶活來達到降低口腔中微生物水平的效果［10］，而較少關(guān)注對已形成的生物膜群落——牙菌斑的清除效果.目前，利用生物方法(酶法)去除牙菌斑的研究應用較少.Inoue等［11］對人體口腔的研究顯示α-1，3-葡聚糖酶漱口液對抑制牙菌斑有顯著的效果.Poulsen等［12］使用含葡聚糖酶的漱口液對大鼠進行研究，結(jié)果表明它對抑制牙菌斑和齲齒的發(fā)生都有顯著效果.α-葡聚糖酶去除牙菌斑的效果雖然很好，但是它較難獲得且價格高.

廣譜的殺滅或抑制口腔細菌的漱口液沒有選擇性，不利于維持口腔正常菌群平衡，甚至可能導致其他口腔疾病，如口腔粘膜炎、口腔潰瘍、真菌感染的白色念珠菌病等.而清除導致齲齒的直接原因牙菌斑有利于維持口腔正常菌群平衡.目前酶制劑對口腔牙菌斑清除效果的人體實驗相當匱乏，故文中開展小范圍的人群實驗，為后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ).

文中采用兩種比較常見的酶——β-葡聚糖酶和α-淀粉酶進行組合，選用食品級酶制劑，開展人體口腔試驗，對比β-葡聚糖酶和α-淀粉酶復合酶漱口液與不添加酶的漱口液、市售精油類漱口液降解牙菌斑的效果，以期獲得能更高效地維持口腔健康的方法.

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

實驗所用的酶全部使用食品級酶(見表1).本實驗中所使用的牙菌斑顯示劑由北京世恒爾力科貿(mào)有限公司提供，制造商是加拿大的GERMIPHENE公司，其主要成分為赤蘚紅.牙菌斑顯示液為食品級試劑，無毒性、無耐藥性.

表1 實驗所用食品級酶Table 1 Food-grade enzymes used in this paper

1.2 漱口液的配制與保藏

實驗組設(shè)置6種不同濃度的自制含酶漱口液、一種無酶漱口液(為陰性對照)以及一種市售的精油類漱口液(作為陽性對照)，共 8種.含酶漱口液(A1－A6)、無酶漱口液(A0)均由實驗室配制.自制含酶漱口液采用β-葡聚糖酶和α-淀粉酶等比例混合溶于磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)配制而成，漱口液含酶量(溶質(zhì)溶劑配比)見表2.無酶漱口液成分除未添加酶液外，其他成分與含酶漱口液完全一致.所選用的陽性對照為某品牌市售精油類漱口液(B)，其有效成分為麝香草酚、桉葉油素、水楊酸甲酯、薄荷醇和乙醇，能夠快速滲透牙菌斑生物膜，可以原位殺死較廣泛的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌［10］.

表2 含酶漱口液配比Table 2 Proportion of enzyme added in mouthwash

PBS緩沖溶液配方:磷酸二氫鉀0.27 g，磷酸氫二鈉1.42g，氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，加去離子水約800mL充分攪拌溶解，再加入濃鹽酸調(diào)pH值至7.4，再使用滅菌的0.22μm過濾器過濾，最后定容到1L.高溫高壓滅菌后置于4℃冰箱保存待用.

酶原液配方:取等量β-葡聚糖酶和α-淀粉酶各0.5g，混合溶于1L PBS緩沖液中，質(zhì)量濃度為1g/L.經(jīng)過高速離心后，使用滅菌的0.22μm過濾器過濾，過濾后置于4℃冰箱保存待用.

含酶漱口液配方:取適量酶原液，用配制的PBS緩沖溶液按配比稀釋，于4℃冰箱保存待用.實驗前用恒溫水浴鍋加熱到35℃.

1.3 實驗對象的納入和排除標準

實驗對象為按納入標準隨機選取的20名在校本科生青年志愿者.所有納入的實驗對象了解本實驗的內(nèi)容和實驗要求，均簽署知情同意書，志愿者有權(quán)在研究過程中在任何時間以任何理由退出研究.納入標準:全身健康狀況良好;全口不得少于20顆功能牙;試驗前3個月內(nèi)未服用抗生素;受試牙及鄰牙無傾斜、發(fā)育異常、牙周袋及牙齦退縮，無冠和固定橋修復及佩帶正畸矯治器，牙面及根面無充填物及齲損，若受檢牙缺失則以對側(cè)同名牙或同側(cè)鄰牙替代;口腔黏膜、牙齦無病理性改變;無吸煙及酗酒習慣;未同時參加其他類似試驗研究.排除標準:正在服用其他可能影響試驗結(jié)果的藥物;在參加實驗前3個月內(nèi)使用過抗生素［13］.

1.4 實驗方法

［13-14］，依以下方法實驗.實驗當天受試者根據(jù)要求在早上進行口腔清潔后正常飲食，直至實驗前不再進行任何口腔清潔措施，晚上十點正式開始實驗.受試者先用滅菌棉簽蘸取適量牙菌斑顯示液輕輕涂在受檢牙面上進行牙菌斑染色，停留30s，然后用清水漱口3次，根據(jù)Tureskey改良的Q-H菌斑指數(shù)計分標準對Ramfjord指數(shù)牙牙面菌斑面積進行菌斑指數(shù)值計分(見表3);每個受試者的6顆Ramfjord指數(shù)牙16、21、24、36、41、44的唇頰面的初菌斑指數(shù)為I1，然后使用給定的漱口液進行含漱2min，每次20mL.含漱結(jié)束后再用清水漱口3次，采用相同方法檢查并記錄后菌斑指數(shù)I2.牙菌斑的改變量為I1－I2，牙菌斑的降低率為(I1－I2)/I1.

每位受試者的菌斑指數(shù)值計分為6顆牙的計分之和除以6.FDI(國際牙科聯(lián)盟)牙位表示法見表4.每單項實驗結(jié)束后恢復日常清潔措施，消除前一種漱口液存在的殘留作用與影響.3d后使用另一種漱口液進行實驗，方法同前.

表3 菌斑指數(shù)計分標準Table 3 Judging standards of plague index

表4 FDI牙位表示法中的Ram fjord指數(shù)牙1)Table 4 Ramfjord tooth in FDI dental notation

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理

試驗結(jié)果采用SPSS18.0軟件包進行兩樣本均數(shù)的t檢驗.顯著性檢測采用LSD法，P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為極顯著差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成分漱口液漱口前后菌斑指數(shù)的變化

對比不同濃度含酶漱口液、以無酶漱口液為陰性對照、一種市售的精油類漱口液為陽性對照，20名志愿者使用漱口液漱口后口腔內(nèi)牙菌斑集聚的降低率呈現(xiàn)一定的規(guī)律.使用市售精油類漱口液后，牙菌斑集聚的平均降低率約為51.04%;而使用僅含PBS的漱口液后，牙菌斑集聚降低率僅為18.02%;使用含不同酶濃度的復合酶漱口液后，牙菌斑集聚降低率約為32%～80%，隨著酶濃度增高，牙菌斑降低率增加，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(見圖1).與無酶漱口液組(A0)相比，使用含酶漱口液后牙菌斑的降低率均有顯著的增加，P＜0.001;表明與無酶漱口液相比，含酶漱口液具有顯著的清除牙菌斑的作用(見圖1、表5).與市售的精油類漱口液組(B組)相比，含酶漱口液也呈現(xiàn)一定的差異.低劑量的含酶組A1、A2(即含酶量為0.5mg/L、1.0mg/L)牙菌斑的降低率低于精油類漱口液組(B組);含酶組A3(即含酶量為2.0 mg/L)牙菌斑降低率與B組相當，而高劑量含酶組A4、A5、A6(即含酶量為5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/ L)顯示出較顯著的優(yōu)勢，牙菌斑的降低率顯著高于B組(P＜0.001，見表6、圖1).這表明使用含酶漱口液對牙菌斑的去除具有明顯效果，漱口液含酶量越大，作用效果越顯著.市售的精油類漱口液也有一定的清除牙菌斑的作用，但高濃度的復合酶漱口液顯示出較市售精油類漱口液更好的效果.

圖1 各組間牙菌斑降低率的比較Fig.1 Comparison of the reduction of dental plague index in different groups

表5 不同濃度含酶組與無酶組的比較Table 5 Comparison between groups with enzyme and without enzyme

表6 不同濃度含酶組與精油類漱口液組的比較Table 6 Comparison between groups with enzyme and commercialmouthwash

分析認為，實驗中所用β-葡聚糖酶專一作用于β-葡聚糖的1，3及1，4糖苷鍵，產(chǎn)生3到5個葡萄糖單位的寡聚糖及葡萄糖.實驗所用α-淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1，4-葡聚糖，無差別地隨機切斷糖鏈內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵，可以清除食物殘渣中的淀粉類物質(zhì)，抑制牙菌斑的形成［7，11］.另一方面，有研究表明α-淀粉酶能夠特異性地與鏈球菌屬結(jié)合［7］，因此漱口液中含有α-淀粉酶可能會影響牙菌斑中的主要群體鏈球菌屬的定植.β-葡聚糖酶和α-淀粉酶復合酶漱口液顯示了良好的消減牙菌斑的效果，進一步的實驗將與α-1，3-葡聚糖酶、α-1，6-葡聚糖酶［15-16］進行組合，預期會有更好的清除牙菌斑的作用效果.

試驗中所用市售精油類漱口液是一種以精油為主要有效成分的漱口液，能夠有效快速地滲透牙菌斑生物膜，并可以原位殺死致病菌.但是在清除牙菌斑方面，效果不如高濃度的含酶漱口液.此外精油類漱口液的主要成分是乙醇、三氯苯氧氯酚和桉精油，其辛辣刺激的口感可能會引起部分消費者的不適.近年來植物化學物在維護口腔健康的作用日益吸引人們的關(guān)注［17-18］.

2.2 不同志愿者在實驗組間牙菌斑降低率的統(tǒng)計分析

對20名志愿者的不同含酶實驗組間牙菌斑降低率數(shù)據(jù)進行無重復雙因素方差分析和回歸分析(見表7)，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)Multiple R(r)＞0，表明菌斑指數(shù)降低率與酶組之間為正相關(guān)，存在一定程度的線性相關(guān);而且20名志愿者的相關(guān)系數(shù)Multiple R值均在0.9以上，R Square(可決系數(shù)R2)值在0.8以上，表明數(shù)據(jù)是可靠的，從而有力地證明了菌斑指數(shù)降低率與含酶各組之間存在高度線性相關(guān)，如表7所示.

表7 不同志愿者在實驗組間菌斑指數(shù)降低率的無重復雙因素方差分析和回歸分析Table 7 Two factors variance and regression analysis of the decrease of dental plague index in volunteers from different experimental groups

3 結(jié)語

漱口是口腔保健的重要措施之一，漱口液清除牙菌斑的效果直接與口腔保健效果相關(guān).本實驗遵守隨機單盲自身對照原則，進行人體口腔實驗，考察復合含酶漱口液清除牙菌斑的效果.結(jié)果顯示β-葡聚糖酶和α-淀粉酶復合酶漱口液含酶組在含酶量大于0.5mg/L時，各組在清除牙菌斑方面均顯著優(yōu)于無酶組(P＜0.001).且當含酶量大于5.0mg/L時，牙菌斑降低率優(yōu)于某市售精油類漱口液，且口感無刺激.故開發(fā)高效去除牙菌斑、口感溫和的復合酶漱口液有廣闊的應用前景.文中所采用的方法和結(jié)論為后續(xù)正在開展的植物化學物在口腔健康中的研究奠定了良好基礎(chǔ).

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Analysis of Elim ination Effect of Enzyme-Combined M outhwash on Dental Plague

Chen Gu Lei Hai-jin Wang Hong Chen Cong-cong Xiang Jia-jia Zhang Shao-bo
(School of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China)

Dental caries is closely related to dental plaque，a biofilm in which bacteria attach to the teeth surface.This paper dealswith the feasibility of eliminating dental plague by using a kind ofmouthwash in which combined enzymes are used to degrade glucan and starch.In the investigation，the Tureskeymodified Q-H indexes of 20 volunteersweremeasured to compare the elimination effectof the enzyme-combinedmouthwash，themouthwash without enzymes and the commercially availablemouthwash with essential oil.Statistical results indicate that，when the enzyme content is higher than 0.5mg/L，the mouthwash containingβ-glucanase andα-amylase ismore effective than the one withoutenzymes;and that，when the enzyme content is higher than 5.0mg/L，the enzyme-combined mouthwash presents a dental plague elimination rate higher than that of the commercially availablemouthwash.It is thus concluded that themouthwash with combined enzymes is effective in eliminating dental plague.This research lays a theoretical foundation for developing products for the daily prevention of dental caries.

dental plague;Q-H dental plague index;enzyme-combined mouthwash;β-glucanase;α-amylase

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31270085)

R78

10.3969/j.issn.1000-565X.2015.06.022

1000-565X(2015)06-0142-05

2014-07-03

國家自然科學基金資助項目(31270085)

陳谷(1973-)，女，博士，副教授，主要從事分子生物學與微生物生理生化研究.E-mail:chengu@scut.edu.cn