劉冬梅 羅彤暉 楊丹霞 黃娟 吳暉 余以剛 李理

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

蠟樣芽孢桿菌LJ01的鑒定及亞硝酸鹽還原酶性質(zhì)*

劉冬梅 羅彤暉 楊丹霞 黃娟 吳暉 余以剛 李理

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

從豆瓣醬中篩選出一株能高效降解亞硝酸鹽的菌株LJ01，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌.通過測(cè)定LJ01細(xì)胞中不同組分的酶活，研究了亞硝酸鹽還原酶的初步定位.LJ01經(jīng)100mg/L的NaNO2誘導(dǎo)后，用溶菌酶破壁，粗酶液先經(jīng)陰離子DEAE Sepharose Fast Flow層析柱分離，測(cè)定不同蛋白組分a、b、c降解亞硝酸鹽的活力，利用0.1mol/L無(wú)機(jī)電子供體丁二酸和亞硫酸鈉等鑒定出組分c為亞硝酸鹽還原酶，再經(jīng)葡聚糖凝膠G-150層析柱分離，獲得較純的亞硝酸鹽還原酶，每升發(fā)酵液可得到0.54mg活性酶蛋白，酶蛋白活力達(dá)到4004.89U/mg，得率為2.37%，純化后其NiR的比活力提高了17.57倍.經(jīng)SDS-PAGE電泳后確定LJ01中亞硝酸鹽還原酶的單體分子質(zhì)量約為30ku.

蠟樣芽孢桿菌;亞硝酸鹽還原酶;亞硝酸鹽降解;16S rDNA;細(xì)胞定位

亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物質(zhì)，在蔬菜發(fā)酵過程中極易積累，給產(chǎn)品帶來(lái)潛在的食品安全問題，且過量攝入亞硝酸鹽可誘發(fā)高鐵血紅蛋白癥［1］，因此嚴(yán)格控制食品中亞硝酸鹽的含量非常重要.許多研究表明亞硝酸鹽是亞硝胺的前體物，亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物，可以誘發(fā)消化系統(tǒng)中的多種癌變，如胃癌、腸癌和肝癌.鑒于食品中可能存在超標(biāo)亞硝酸鹽污染、肉制品中含有亞硝酸鹽、水產(chǎn)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽超標(biāo)等可能導(dǎo)致食品安全潛在問題，尋求有效控制或降解亞硝酸鹽的方法勢(shì)在必行.

加入食用安全(GRAS)的微生物是目前用于食品中亞硝酸鹽降解的主要方法之一，主要有植物乳桿菌(Lactobacillus plantrum)［2］、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)［3］、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)［4］.還可利用NiR進(jìn)行亞硝酸鹽的生物降解，但是要得到大量的食用安全的NiR還沒有很好的方法.NiR是一種還原酶，主要催化反硝化過程中的亞硝酸鹽還原為一氧化氮，催化過程中存在電子傳遞，因此NiR要發(fā)揮其催化作用需要電子供體與電子受體，電子供體將電子傳遞給NiR，隨后亞硝酸鹽從該酶上得到電子而被還原，其中亞硝酸鹽為其電子受體［5］，而其電子供體尚未明確.

筆者所在課題組在分析豆瓣醬中的微生物種群時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中的菌株LJ01有很強(qiáng)的降解亞硝酸鹽的能力，當(dāng)NaNO2質(zhì)量濃度為20～200mg/L時(shí)，在24h內(nèi)LJ01能將亞硝酸鹽完全降解;當(dāng)NaNO2質(zhì)量濃度為250mg/L時(shí)，降解率為99.31%.在NiR的研究領(lǐng)域，從芽孢桿菌中進(jìn)行NiR的性質(zhì)和純化研究鮮有報(bào)道.文中首先對(duì)菌株LJ01進(jìn)行了分子和生理生化方面的鑒定，用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定NaNO2含量而測(cè)定NiR酶活，并從LJ01細(xì)胞內(nèi)提取出NiR酶液，依次通過陰離子DEAE Sepharose Fast Flow凝膠層析柱、葡聚糖G-150凝膠層析柱的分離純化，利用無(wú)機(jī)物電子供體丁二酸和亞硫酸鈉對(duì)分離后的組分進(jìn)行了鑒定，最后還利用SDS-PAGE電泳對(duì)NiR的分子質(zhì)量進(jìn)行確定.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus LJ01由筆者所在課題組從豆瓣醬中分離純化所得，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.9360.

1.1.2 材料與試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯，生化試劑，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;鹽酸萘乙二胺，分析純，華東師范大學(xué)化工廠生產(chǎn);對(duì)氨基苯磺酸，分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司生產(chǎn);HEPES、胰蛋白酶抑制劑、牛血清蛋白，生化試劑，購(gòu)自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;氯化鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn);溶菌酶，生化試劑，購(gòu)自北京天恩澤生物公司;二硫蘇糖醇(DTT)，生化試劑，購(gòu)自上海Sigma公司;Tris，生化試劑，購(gòu)自健陽(yáng)生物科技有限公司;聚乙二醇20000，生化試劑，韓國(guó)夏普公司生產(chǎn).

1.1.3 試劑溶液及培養(yǎng)基

50mmol/L HEPES緩沖液(pH=7.4);50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0);NiR酶提緩沖液:在100mL的50mmol/L HEPES緩沖液(pH=7.4)中加入0.5mL的1mol/L的DTT，使其終濃度為5mmol/L，并在其中加入0.1mL的2g/L胰蛋白酶抑制劑，混合均勻后即為NiR酶提緩沖液;種子培養(yǎng)基(1L):10g大豆蛋白胨，5g氯化鈉，3g酵母提取粉;NiR誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基(1L):10 g大豆蛋白胨，5 g氯化鈉，3 g酵母提取粉，20mL 5g/L NaNO2溶液.

1.2 主要儀器與設(shè)備

紫外可見光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司生產(chǎn));PHS3-C pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn));5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司生產(chǎn));層析柱;HL-2B恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司生產(chǎn));DYCZ-24DN電泳槽(北京市六一儀器廠生產(chǎn));酶標(biāo)儀;01J2003-04立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn));Biostat Aplus 5L發(fā)酵罐(德國(guó)Sartorius公司生產(chǎn)).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分子生物學(xué)鑒定和生理生化鑒定

DNA的提取參照參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行.

PCR擴(kuò)增方法如下.16SrDNA引物及序列為M13F(-47):CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC; M13R(-48):AGCGGATAACAATTTCACACAGG A.首先以菌株LJ01的DNA為模板，以M13F(-47)和M13R(-48)引物在一定條件下擴(kuò)增，然后利用瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物的特異性.割膠回收純化PCR產(chǎn)物后克隆到質(zhì)粒pMD18-T，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH 5α，最后測(cè)序驗(yàn)證重組克隆中PCR產(chǎn)物的序列信息.重組克隆條件:氨芐青霉素抗性;質(zhì)粒DNA體積:10～20μL;含質(zhì)粒的菌液體積:200～300μL;儲(chǔ)存條件:－20℃.

生理生化鑒定:分離株的一般形態(tài)生理生化檢測(cè)分析可參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第9版)［7］進(jìn)行.

1.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

把測(cè)序結(jié)果與BLAST中的序列進(jìn)行比對(duì)，將搜索出的相關(guān)序列以FASTA格式導(dǎo)入多序列比對(duì)工具CLUSTALX(versionl.83)中，比對(duì)結(jié)果使用MEGA (version5.0)中的鄰接法(Neighbor-Joiningmethod)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，然后輸出進(jìn)化樹圖.

1.3.3 亞硝酸鹽測(cè)定

亞硝酸鹽含量的測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB/T 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的鹽酸萘乙二胺法進(jìn)行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.0404x－0.0024(式中Y為吸光值;x為亞硝酸鹽質(zhì)量濃度，單位為mg/L;回歸系數(shù)為0.9999).采用紫外可見光分光光度法測(cè)定NiR酶蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測(cè)定不同濃度牛血清蛋白在280nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y'=0.618x'－2.133(式中Y'為吸光值×1000;x'為蛋白質(zhì)量濃度，單位為mg/L;回歸系數(shù)為0.9996).

1.3.4 NiR酶活力的測(cè)定

粗酶酶活測(cè)定體系:在1.5mL離心管中加入粗酶液100μL、濃度500mg/L的NaNO2溶液100μL，再用50mmol/L HEPES緩沖液(pH=7.4)定容到500μL，使亞硝酸鹽的終濃度為100mg/L，于37℃下反應(yīng)24h后，按1.3.3節(jié)的方法測(cè)定NaNO2含量.

葡聚糖凝膠層析純化酶酶活測(cè)定體系:在1.5mL離心管中加入目的酶液100μL、陰離子0或100mmol/L洗脫蛋白液100μL、100μL的500mg/L NaNO2，使其終濃度為100mg/L，再用HEPES緩沖液定容到500μL，于37℃下反應(yīng)24h后，按1.3.3節(jié)的方法檢測(cè)NaNO2的含量.

確定NiR組分酶活測(cè)定體系:在1.5mL離心管中加入目的酶液(0、100、或200mmol/L)100μL、100μL的500mg/L NaNO2，使其終濃度為100mg/L，然后加入100μL的 0.1 mol/L丁二酸或亞硫酸鈉，再用HEPES緩沖液定容到500μL，于37℃下反應(yīng)24 h后，按1.3.3節(jié)的方法檢測(cè)NaNO2的含量.

亞硝酸鹽還原酶的酶活單位定義為:在37℃條件下，每分鐘催化還原1ng亞硝酸鈉所用酶量為一個(gè)酶活力單位.酶活(U/mg)計(jì)算公式如下:酶活= m/(Mt)，其中m為降解的亞硝酸鈉的質(zhì)量，ng;M為反應(yīng)物中酶蛋白質(zhì)的質(zhì)量，mg;t為反應(yīng)時(shí)間，min.

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)外亞硝酸鹽還原酶的確定

至22～24 h達(dá)到最大的亞硝酸鹽降解量約為200mg/L.將活化LJ01種子液以2%的體積分?jǐn)?shù)接種至含200mg/LNaNO2的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24h后，即得含NiR的LJ01細(xì)胞液(簡(jiǎn)稱為CBINR).將CBINR分成兩份:第1份離心20min后(8000 r/min，4℃)，取上清液過0.22μm的膜，收集過膜后的液體為細(xì)胞外酶組分;第2份進(jìn)行超聲破碎(55%，10min，2 s停2 s)，離心20min后(8 000 r/min，4℃)取上清液，即為細(xì)胞外酶和細(xì)胞內(nèi)酶組分.所得的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)酶、細(xì)胞外酶按照1.3.3節(jié)的方法測(cè)NiR的酶活.細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的NiR酶活測(cè)定分別做3個(gè)平行.

1.3.6 亞硝酸鹽還原酶的分離純化

(1)NiR粗酶液的制備.將活化LJ01種子液以2%的體積分?jǐn)?shù)接種至NiR誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃和180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，將CBINR離心10min(8000 r/min，4℃)后，棄去上清液后，用無(wú)菌水洗后離心10min(8000 r/min，4℃)，清洗和離心重復(fù)2次得含NiR的LJ01細(xì)胞(簡(jiǎn)稱為CINR)并稱重，將CINR懸浮于NiR酶提緩沖液中，成為終質(zhì)量濃度為200g/L(濕菌體重/緩沖液)的菌懸液，在該菌懸液中加入20.0g/L的溶菌酶，使溶菌酶濃度為0.10%(體積分?jǐn)?shù))，混勻，于30℃下靜置4h以充分溶解CINR的細(xì)胞壁，得到細(xì)胞周質(zhì)組分后離心20min(8000 r/min，4℃)，上清液為CINR粗酶液.

(2)DEAE Sepharose Fast Flow交換層析.取40mL CINR粗酶液上樣至 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析柱(2.6 cm×20 cm)，先用不含NaCl的50mmol/L HEPES緩沖液(pH=7.4)將雜蛋白洗脫下來(lái)，再用0～300mmol/L NaCl的50mmol/L HEPES緩沖液(pH=7.4)進(jìn)行梯度洗脫，流速為1mL/min，分部收集洗脫液，每管收集洗脫液1.5mL，按照1.3.3節(jié)的方法測(cè)定每管洗脫液的蛋白質(zhì)含量，按照1.3.3和1.3.4節(jié)的方法測(cè)定降解亞硝酸鹽的活性及測(cè)定NiR酶活，收集和合并有NiR酶活的組分，再用聚乙二醇20000濃縮至所需濃度，于4℃保存?zhèn)溆?

(3)Sephadex G-150葡聚糖凝膠過濾層析.將10 mL經(jīng)聚乙二醇20000濃縮后的酶液上樣于預(yù)先用50mmol/L、pH=8.0的Tris-HCl緩沖液平衡好的Sephadex G-150葡聚糖凝膠柱(1.6 cm×50 cm)過濾層析，再用同一緩沖液洗脫，分部收集，洗脫流速為0.5mL/min，每管收集洗脫液3mL，按照1.3.3節(jié)的方法測(cè)定每管洗脫液的蛋白質(zhì)含量，按照1.3.3和1.3.4節(jié)的方法測(cè)定降解亞硝酸鹽的活性及測(cè)定NiR酶活，收集和合并含有NiR酶活的組分，再用聚乙二醇20000濃縮至所需濃度，于4℃保存?zhèn)溆?

1.3.7 亞硝酸鹽還原酶分離純化后蛋白質(zhì)性質(zhì)的鑒定

在NiR酶活反應(yīng)體系中加入100μL的蛋白組分a，b或c、100μL NaNO2溶液(500mg/L)、100μL的0.1mol/L的丁二酸溶液或亞硫酸鈉溶液、200μL HEPES緩沖液，反應(yīng)14h后，按照1.3.3節(jié)方法測(cè)定體系的亞硝酸鹽含量，分別計(jì)算組別No.1－No.6(見表1)的比酶活，單位為U/mL.

表1 NiR組分的性質(zhì)鑒定反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for identifying the NiR fraction

1.3.8 NiR分子質(zhì)量的SDS-PAGE電泳鑒定

將粗酶液、過DEAE Sepharose Fast Flow交換層析柱后的酶液、過Sephadex G-150柱層析后的酶液分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，分離膠為12.5%，濃縮膠為4%，電極緩沖液為Tris-甘氨酸，電壓先為80 mV，后為100mV，電泳完成后，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，再脫色后拍照.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株LJ01的16S rDNA克隆測(cè)序

本研究選擇克隆的質(zhì)粒為pMD18-T［8］，同時(shí)以與該質(zhì)粒相匹配的M13引物［9-10］來(lái)進(jìn)行克隆測(cè)序.將具有降解亞硝酸鹽的菌株LJ01的16S rDNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后進(jìn)行測(cè)序，將所測(cè)得的序列(見圖1)上傳至NCBI網(wǎng)站，檢索號(hào)為KM058698.將LJ01的16S rDNA序列通過BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可知，菌株LJ01與蠟樣芽孢桿菌相似度很高，因此初步鑒定菌株LJ01屬于芽孢桿菌屬.根據(jù)16S rDNA克隆測(cè)序的序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖2)，可知LJ01與蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus F837/76具有較高的相似性.

圖1 LJ01的16S rDNA序列Fig.1 The 16S rDNA sequences of LJ01

圖2 LJ01進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of LJ01

2.2 LJ01生理生化鑒定

對(duì)菌株LJ01進(jìn)行生理生化特征分析表明，菌株LJ01菌落表面干燥呈不規(guī)則狀，邊緣不整齊且有凸起，菌體能運(yùn)動(dòng)，桿狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性，有芽孢，兼性厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，氧化酶試驗(yàn)為陰性，能液化明膠，還原硝酸鹽，能水解淀粉，苯丙氨酸脫氨酶為陰性，能耐受2%～10%的NaCl濃度，不能利用檸檬酸鹽，卵凝脂酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)為陰性，脲酶試驗(yàn)為陰性，酪素水解為陰性，酪氨酸水解為陰性，V-P試驗(yàn)為陽(yáng)性，不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、葡萄糖，可以利用D-葡萄糖，能在30、40℃下生長(zhǎng)，在50℃下不生長(zhǎng).綜合菌株LJ01的保守序列16S rDNA的序列信息、進(jìn)化樹、形態(tài)特征和生理生化特征，對(duì)照伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［7］，鑒定菌株LJ01為蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus).

2.3 LJ01的亞硝酸鹽還原酶的初步定位

采用細(xì)胞組分法分離細(xì)胞NiR，對(duì)各組分進(jìn)行降解亞硝酸鹽活力測(cè)定，結(jié)果如表2所示.LJ01細(xì)胞內(nèi)外組分的NaNO2降解量為94.04mg/L，而細(xì)胞外組分的NaNO2降解量為19.04mg/L，得到細(xì)胞內(nèi)組分的NaNO2降解量為75mg/L，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)組分對(duì)亞硝酸鹽的降解量比細(xì)胞外組分強(qiáng)，表明菌株LJ01的NiR主要位于細(xì)胞內(nèi).根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，NiR是一種胞內(nèi)酶，且位于細(xì)胞周質(zhì)或者是結(jié)合在細(xì)胞膜上的酶，Blackmore等［11］用細(xì)胞裂解法分析 Wolinella succinogenes中的NiR，證實(shí)NiR主要位于細(xì)胞內(nèi).與空白相比，細(xì)胞外組分僅能少量降解亞硝酸鈉，原因可能為:①離心力較高造成個(gè)別細(xì)胞破裂，細(xì)胞周質(zhì)組分流失，致使上清液中有少量NiR;②細(xì)胞外確實(shí)有少量NiR，但是由于酶活較低，因此不考慮細(xì)胞外的NiR組分.通過測(cè)定細(xì)胞組分的NiR酶活，初步證實(shí)了LJ01的NiR是一種胞內(nèi)酶.用溶菌酶處理得到的粗酶主要來(lái)源于細(xì)胞周質(zhì)，此組分有較高的酶活，進(jìn)一步說(shuō)明LJ01的NiR主要位于細(xì)胞內(nèi)，但NiR在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的精確定位還需要運(yùn)用免疫膠體金等精確的定位方法［12］.

表2 LJ01中NiR的細(xì)胞內(nèi)外定位Table 2 Extracellular and intracellular localization of NiR in LJ01

2.4 NiR的分離純化

LJ01粗酶液過DEAE Sepharose Fast Flow后的蛋白洗脫曲線如圖3所示，從左到右蛋白峰a、b、c的洗脫鹽濃度分別為0、100、200mmol/L，而當(dāng)鹽濃度大于300mmol/L時(shí)無(wú)蛋白峰洗出.a、b、c單個(gè)蛋白組分無(wú)NiR酶活，當(dāng)組分a與c、b與c分別混合時(shí)有NiR酶活，a與b組分混合時(shí)無(wú)NiR酶活，表明組分c是一個(gè)關(guān)鍵的組分.亞硝酸鹽的降解是一種氧化還原反應(yīng)，在此反應(yīng)中必須有電子提供者和接受者，是電子受體，NiR具有傳遞電子和實(shí)現(xiàn)催化反應(yīng)的酶［13］，上述現(xiàn)象表明為實(shí)現(xiàn)降解亞硝酸鹽，除了NiR外，還需要電子提供者.Coyne等［14］的研究表明，一種反硝化細(xì)菌中不會(huì)同時(shí)存在兩種NiR，但是可能存在多種電子供體，因此推測(cè)，經(jīng)200mmol/L氯化鈉洗脫下來(lái)的蛋白組分c是目標(biāo)蛋白NiR，同時(shí)說(shuō)明a、b兩種洗脫蛋白在降解亞硝酸鹽過程中不可或缺;Moir等［15］的研究表明，經(jīng)100mmol/L氯化鈉洗脫出的藍(lán)銅蛋白為假天青蛋白，是NiR的電子供體的一種，所以a、b兩種電子供體的蛋白混合沒有NiR活性.收集有NiR活性的組分c，用聚乙二醇20000濃縮后于－4℃下貯存以備用.對(duì)組分c進(jìn)行洗脫，洗脫曲線見圖4.由圖可知，洗脫過程中出現(xiàn)3個(gè)不同的蛋白峰1、2、3，也需要加入組分a或b才有NiR酶活，蛋白峰2的NiR活性最強(qiáng)，收集有NiR活性的組分，用聚乙二醇20000濃縮后于－4℃下保存?zhèn)溆?

圖3 LJ01粗酶液的DEAE Sepharose Fast Flow層析Fig.3 Chromatography of LJ01 crude enzyme solution on DEAE Sepharose Fast Flow

圖4 NiR的Sephadex G-150凝膠過濾層析Fig.4 Gel chromatographic separation of NiR on Sephadex G-150

為進(jìn)一步驗(yàn)證組分a和b為電子供體蛋白質(zhì)、組分c為NiR，用可提供電子的化合物丁二酸、亞硫酸鈉等進(jìn)行亞硝酸鹽降解，結(jié)果如表3所示.從表3可以看出，亞硫酸鈉和丁二酸均可以為NiR提供電子，但組分a、組分b與亞硫酸鈉和丁二酸反應(yīng)均無(wú)NiR活性，而組分c與亞硫酸鈉和丁二酸反應(yīng)后均有NiR活性，表明組分c中含有NiR，也進(jìn)一步證實(shí)了組分a和b中含有亞硝酸鹽降解的電子供體，同時(shí)在相同濃度下，丁二酸提供電子的能力比亞硫酸鈉強(qiáng).

組分c經(jīng)葡聚糖凝膠層析后被收集到的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PEAG電泳分析(見圖5)，條帶4、5與2、3相比，在相同處出現(xiàn)條帶，單體的分子質(zhì)量最可能為60ku，這與Vigara等［16］研究的粒藻中含鐵氧還原蛋白的亞硝酸鹽還原酶(其分子質(zhì)量為63 ku)接近.由于是變性電泳的結(jié)果，LJ01中組分c是三聚體或二聚體還需要進(jìn)一步研究.Coyne等［14］指出，NiR是在厭氧條件下產(chǎn)生的酶，研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌LJ01在有氧情況下可以產(chǎn)生NiR，而且含量低但NiR活性高.Moir等［15］發(fā)現(xiàn)在厭氧或需氧情況下培養(yǎng)的細(xì)胞中僅檢測(cè)到NiR是cd1型，經(jīng)SDS-PAGE電泳后確定LJ01中亞硝酸鹽還原酶的單體分子質(zhì)量約為30 ku，與文獻(xiàn)［16-17］中報(bào)道的二聚體蛋白cd1型亞硝酸鹽還原酶單體分子質(zhì)量接近，與Cu型亞硝酸鹽還原酶單體分子質(zhì)量(約為36ku)相差較大，因而推測(cè)菌株LJ01產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶可能為cd1型.

表3 加入電子供體后各洗脫峰的酶活Table 3 Enzyme activity of each eluting peak after adding an electron donor

圖5 LJ01中NiR的電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of NiR in LJ011—蛋白標(biāo)準(zhǔn)品;2—粗酶液;3—經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析后組分;4—葡聚糖G-150凝膠層析后19管組分;5—葡聚糖G-150凝膠層析后18管組分

2.5 LJ01的NiR純化后的酶活

LJ01各部純化后的結(jié)果見表4，從表中可以看出，通過離子交換柱層析分離和凝膠過濾層析分離純化，所得的蛋白逐漸減少，凝膠過濾后只得到0.54mg蛋白(原料為從1L菌液中提取得到的400mg粗蛋白)，但是還未達(dá)到電泳純，分離純化過程中NiR酶被提純了17.57倍，酶活得率為2.37%，經(jīng)葡聚糖凝膠純化后的NiR酶活達(dá)到4004.89U/mg.

表4 LJ01中的NiR純化結(jié)果1)Table 4 Purification results of NiR in LJ01

3 結(jié)語(yǔ)

從豆瓣醬中篩選出一株能高效降解亞硝酸鹽的菌株LJ01，綜合其形態(tài)、生理生化特性以及16S rDNA基因序列，將LJ01鑒定為蠟樣芽孢桿菌.通過測(cè)定LJ01細(xì)胞中不同組分的酶活研究了亞硝酸鹽還原酶的初步定位.LJ01經(jīng)100mg/L的NaNO2誘導(dǎo)后，用溶菌酶破壁后的粗酶液先經(jīng)陰離子DEAE Sepharose Fast Flow層析柱分離，測(cè)定不同蛋白組分a、b、c降解亞硝酸鹽的活力，利用0.1mol/L無(wú)機(jī)電子供體丁二酸和亞硫酸鈉等鑒定出組分c為亞硝酸鹽還原酶，再經(jīng)葡聚糖凝膠G-150層析柱分離，獲得較純的亞硝酸鹽還原酶，酶活達(dá)到4004.89U/mg，得率為2.37%，純化后其NiR的酶活提高了17.57倍.經(jīng)SDS-PAGE電泳后確定LJ01中亞硝酸鹽還原酶的單體分子質(zhì)量約為30 ku.關(guān)于蠟樣芽孢桿菌中NiR的研究還未見報(bào)道，因此對(duì)LJ01中的NiR需要進(jìn)一步研究.例如，進(jìn)一步純化以得到純度更高度NiR蛋白，制備NiR抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)精確定位，為更好地純化提供借鑒;另外還需要對(duì)LJ01中NiR的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)做更深入的研究.

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Identification and Nitrite Degradation Ability of Bacillus cereus LJ01

Liu Dong-mei Luo Tong-hui Yang Dan-xia Huang Juan Wu Hui Yu Yi-gang Li Li
(School of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China)

A strain LJ01 with strong nitrite degradation abilitywas isolated from fermented bean paste and was identified as Bacillus cereus.Then，the primary cell localization of this nitrite reductasewas examined bymeasuring the enzyme activity of different cellular components from LJ01 cell.After LJ01 was induced by 100mg/L sodium nitrite solution and treated with lysozyme，the crude enzyme solution of LJ01 was first separated by means of the anion DEAE Sepharose Fast Flow chromatography，and the nitrite degradation activity of fractions a，b and c wasmeasured.Moreover，by using inorganic electron donors such as 0.1mol/L succinic acid and sodium sulfite solution，fraction c was identified as a critical nitrite reductase and was separated by Sephadex G-150 column to get pure protein.The identification results show that 0.54mg of active enzyme protein with an activity of 4004.89U/mg can be obtained from 1L of the fermentation liquid，and that the specific NiR activity of the purified enzyme increases by 17.57 foldswith a recovery of 2.37%.In addition，SDS-PAGE results show that themonomermolecularmass of LJ01 is about 30ku.

Bacillus cereus;nitrite reductase;nitrite degradation;16S rDNA;cell localization

s:Supported by the National Natural Science Foundation of China(31101254)，the Natural Science Foundation of Guangdong Province(S2011010005679)and the Key Science and Technology Program of Guangdong Province(2013B020312002，2014A020208019，412051029089)

Q939.97

10.3969/j.issn.1000-565X.2015.06.021

1000-565X(2015)06-0135-07

2014-10-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101254);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2011010005679);廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013B020312002，2014A020208019，412051029089);華南理工大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(D2116760)

劉冬梅(1972-)，女，博士，副教授，主要從事食品微生物的利用與控制研究.E-mail:liudm@scut.edu.cn