王道會(huì)，武玉民，張?jiān)迄i*，劉 玲

（1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042；2.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司，山東 青島 266400）

葡萄糖酸鈉又名五羥基己酸鈉，分子式為C6H11O7Na[1]。由于無(wú)毒、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，在建筑工業(yè)、食品、醫(yī)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用[2-4]。其傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式主要有黑曲霉生物發(fā)酵法、多相催化氧化法、電解氧化法等[5-7]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉已經(jīng)成為可能，并且更具先進(jìn)性。酶法生產(chǎn)工藝主要是利用葡萄糖氧化酶[8-9]和過(guò)氧化氫酶直接將葡萄糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，經(jīng)中和制得葡萄糖酸鹽系列產(chǎn)品。此方法具有不需要菌種、不受各種輔料濃度影響[10-11]、節(jié)省能源、工藝簡(jiǎn)化、操作方便、底物濃度高且純度好、便于提取精制等特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)利用葡萄糖氧化酶及過(guò)氧化氫酶生產(chǎn)葡萄糖酸鈉，通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討了最佳的工藝條件，并與黑曲霉發(fā)酵法在發(fā)酵時(shí)間、產(chǎn)品質(zhì)量等方面進(jìn)行對(duì)比，為葡萄糖酸系列產(chǎn)品的生產(chǎn)探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖（工業(yè)級(jí)）：西王集團(tuán)有限公司；葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD），酶活力10 000 U/g、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT），酶活力60 000 U/g：天津諾維信酶制劑公司；302#活性炭：溧陽(yáng)市華東活性炭有限公司；酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；尿素：山東省寧津縣化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ33-FZ-Q-5L5L全自動(dòng)發(fā)酵罐：西華儀科技有限公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海鷹迪設(shè)備有限公司；FE20pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖酸鈉合成原理[12]

1.3.2 合成方法

將葡萄糖溶解于水配制成3 L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的葡萄糖漿，調(diào)節(jié)pH至5.5，加入葡萄糖氧化酶3～5 mL/g（以葡萄糖質(zhì)量的1%計(jì)），攪拌均勻后加入過(guò)氧化氫酶2～5 mL/g（以葡萄糖質(zhì)量的0.75%計(jì)），調(diào)節(jié)葡萄糖氧化酶及過(guò)氧化氫酶的添加量，反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間等以探究最優(yōu)的葡糖氧化酶及過(guò)氧化氫酶的反應(yīng)條件。

1.3.3 葡萄糖氧化酶及過(guò)氧化氫酶反應(yīng)條件優(yōu)化

反應(yīng)溫度實(shí)驗(yàn)：控制相同的反應(yīng)初糖含量33%，在酶添加量、罐壓、風(fēng)量、攪拌轉(zhuǎn)速保持一致的情況下，測(cè)定25℃、28℃、32℃、35℃、40℃條件下20 h的殘?zhí)呛俊?/p>

攪拌轉(zhuǎn)速實(shí)驗(yàn)：控制相同的反應(yīng)初糖含量33%，在酶添加量、風(fēng)量、罐壓、反應(yīng)時(shí)間一致的情況下，測(cè)定100r/min、130 r/min、160 r/min、190 r/min、220 r/min條件下20 h時(shí)的殘?zhí)呛俊?/p>

風(fēng)量實(shí)驗(yàn)：控制相同的反應(yīng)初糖含量33%，在酶添加量、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速、反應(yīng)時(shí)間一致的情況下，測(cè)定1 200 m3/h、1400m3/h、1600m3/h、1800m3/h條件下20h時(shí)的殘?zhí)呛俊?/p>

酶添加量?jī)?yōu)化：控制相同的反應(yīng)初糖含量33%，在罐壓、通風(fēng)量、轉(zhuǎn)速、反應(yīng)時(shí)間保持一致的情況下，調(diào)節(jié)發(fā)酵葡萄糖氧化酶與過(guò)氧化氫酶的添加量，測(cè)定最終殘?zhí)呛俊?/p>

1.3.4 黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉

黑曲霉發(fā)酵法所用發(fā)酵配方為葡萄糖350 g/L，酵母浸粉0.25g/L，尿素2g/L，pH6.0。在溫度31℃，風(fēng)量1600m3/h，轉(zhuǎn)速220 r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵，待發(fā)酵殘?zhí)墙抵?.7 g/100 mL后結(jié)束發(fā)酵，并同酶法發(fā)酵法進(jìn)行比較。

1.3.5 殘?zhí)菧y(cè)定方法

按照參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行。

1.3.6 酶法及發(fā)酵法葡萄糖酸鈉提取實(shí)驗(yàn)及比較

對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理，取酶法與發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)酵液各2 L，分別調(diào)pH值，均調(diào)至6.6～7.2。將調(diào)好pH值的發(fā)酵液分別添加4.6 g 302#活性炭，水浴升溫至60～70℃保溫脫色40 min，過(guò)濾。對(duì)比發(fā)酵液的脫色率及過(guò)濾時(shí)間。按照參考文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定溶液脫色率。對(duì)脫色清液進(jìn)行濃縮，濃縮至起晶，過(guò)濾，得濾餅用蒸餾水洗滌后放于烘箱中烘干。對(duì)晶體進(jìn)行稱量分析，對(duì)比晶體質(zhì)量。按照參考文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定葡萄糖酸鈉的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶及過(guò)氧化氫酶反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)酶法殘?zhí)呛康挠绊?/p>

表1 反應(yīng)溫度對(duì)殘?zhí)呛康挠绊慣able 1 Effect of reaction temperature on residual sugar content

通過(guò)表1可以看出，在25～32℃時(shí)，殘?zhí)呛侩S著溫度的升高而逐漸降低，但當(dāng)溫度＞32℃時(shí)，殘?zhí)呛侩S著溫度升高而升高，而且在不同溫度條件下殘?zhí)呛坎顒e較大，32℃時(shí)殘?zhí)呛孔畹汀＿@是因?yàn)樯鲜鰞煞N酶是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)對(duì)反應(yīng)溫度特別敏感，溫度升高會(huì)加快反應(yīng)速度，但是隨著溫度的繼續(xù)增加，酶活會(huì)有所降低甚至被滅活；溫度過(guò)低，酶的活性受到抑制，反應(yīng)速度同樣會(huì)降低。因此最適反應(yīng)溫度為32℃。

2.1.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)殘?zhí)墙到獾挠绊?/p>

表2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)殘?zhí)呛康挠绊慣able 2 Effect of stirring speed on residual sugar content

通過(guò)表2可以看出，在100～220 r/min時(shí)，增加轉(zhuǎn)速殘?zhí)呛恐饾u減少，在190～220 r/min時(shí)殘?zhí)墙档筒幻黠@，隨著轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加，殘?zhí)呛糠炊噬仙厔?shì)，這可能是由于隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，酶與糖液接觸頻繁，反應(yīng)速率增快，但繼續(xù)增加攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)酶造成一定的破壞，殘?zhí)呛拷档?，考慮成本及殘?zhí)墙到庑Ч?，選擇攪拌轉(zhuǎn)速190 r/min為宜。

2.1.3 通風(fēng)量對(duì)殘?zhí)呛康挠绊?/p>

表3 通風(fēng)量對(duì)殘?zhí)呛康挠绊慣able 3 Effect of air volume on residual sugar content

通過(guò)表3可以看出，隨著通風(fēng)量的不斷升高，殘?zhí)呛砍式档挖厔?shì)，但是風(fēng)量從1 600 m3/h升至1 800 m3/h時(shí)，殘?zhí)墙到馑俾什幻黠@，這是因?yàn)殡S著風(fēng)量的提高，酶與糖液的接觸更加頻繁，增加了單位時(shí)間的接觸面，但當(dāng)風(fēng)量再高時(shí)，酶與糖液的接觸面積已經(jīng)不能再提高，使殘?zhí)墙到馑俾什辉僭黾??？紤]成本因素，控制風(fēng)量在1 600 m3/h即可。

2.1.4 酶添加量對(duì)殘?zhí)墙到獾挠绊?/p>

表4 葡糖氧化酶添加量對(duì)殘?zhí)呛康挠绊慣able 4 Effect of GOD addition on residual sugar content

通過(guò)表4可以看出，在固定過(guò)氧化氫酶添加量為3 mL/g的情況下，隨著葡萄糖氧化酶含量的增加，殘?zhí)呛拷档?，但是? mL/g時(shí)已經(jīng)達(dá)到飽和，再增加對(duì)最終殘?zhí)呛康慕档筒幻黠@。因此固定葡萄糖氧化酶4 mL/g，調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶的含量。

在固定葡萄糖氧化酶添加量為4 mL/g的情況下，隨著過(guò)氧化氫酶含量的增加，殘?zhí)呛拷档?，但是? mL/g時(shí)已達(dá)到飽和，完成催化作用，再增加對(duì)最終殘?zhí)墙档筒幻黠@。通過(guò)表4和表5，最終選擇葡萄糖氧化酶添加量為4 mL/g，過(guò)氧化氫酶添加量在3 mL/g。

2.2 酶法與發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的對(duì)比

2.2.1 生產(chǎn)周期及最終發(fā)酵殘?zhí)堑膶?duì)比

圖1 酶法和生物法對(duì)發(fā)酵時(shí)間及殘?zhí)呛康挠绊慒ig.1 Effect of enzyme and fermentation method on fermentation time and residual sugar content

通過(guò)圖1可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵法與酶法的發(fā)酵液殘?zhí)呛慷冀档停敲阜ǖ姆磻?yīng)時(shí)間更快，發(fā)酵周期更短。這可能是由于酶法直接與培養(yǎng)液接觸，直接催化反應(yīng)的發(fā)生，而微生物法則需要由微生物生長(zhǎng)并產(chǎn)酶，需要一定的時(shí)間，所以發(fā)酵進(jìn)程前期較緩，中期速度較快，在10～18 h達(dá)到最高峰，后期則因菌種老化死亡，發(fā)酵變緩。酶法較發(fā)酵法生產(chǎn)周期上要縮短5～8 h的時(shí)間，這樣可以節(jié)省大量的能耗，同時(shí)還可以省去菌種培養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)室等輔助生產(chǎn)設(shè)施。

2.2.2 酶法與發(fā)酵法發(fā)酵液脫色效果及過(guò)濾時(shí)間對(duì)比

表5 過(guò)氧化氫酶添加量對(duì)殘?zhí)呛康挠绊慣able 5 Effect of CAT addition on residual sugar content

由表5可以看出，在相同活性炭添加量、相同脫色時(shí)間的情況下，酶法比發(fā)酵法得到的發(fā)酵液脫色率更高。這是由于發(fā)酵法在發(fā)酵過(guò)程中菌體會(huì)產(chǎn)生色素等雜質(zhì)，而酶法生產(chǎn)則沒(méi)有這些雜質(zhì)，因此在相同情況下，酶法的脫色效果比發(fā)酵法要好。

在相同活性炭添加量及珍珠巖添加量的情況下，酶法過(guò)濾速度要比發(fā)酵法快出幾倍。這是由于酶法在反應(yīng)過(guò)程中不產(chǎn)生菌絲體等蛋白質(zhì)物質(zhì)，可以減輕過(guò)濾的壓力，從而提高過(guò)濾速度。

2.2.3 酶法與發(fā)酵法的產(chǎn)品質(zhì)量對(duì)比

表6 酶法與發(fā)酵法發(fā)酵液脫色效果對(duì)比Table 6 Comparison of enzyme and fermentation method on fermented liquid decoloration effect

由表6可以看出，酶法生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量比菌種發(fā)酵好，這是由于在菌種發(fā)酵過(guò)程中需要添加各種營(yíng)養(yǎng)鹽等輔料以及菌體自溶等因素產(chǎn)生的很多物質(zhì)在后續(xù)提取過(guò)程中有的難以提取出來(lái)，致使產(chǎn)品純度低，還原物含量高，pH值偏低。

3 結(jié)論

酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的最佳工藝條件為：在溫度32℃、轉(zhuǎn)速190 r/min、通風(fēng)量1 600 m3/h、葡萄糖氧化酶添加量為4 mL/g，過(guò)氧化氫酶添加量在3 mL/g的條件下最好，殘?zhí)墙到馑俣茸羁臁?/p>

通過(guò)對(duì)比酶法與發(fā)酵法的生產(chǎn)時(shí)間、生產(chǎn)殘?zhí)?、脫色效果、過(guò)濾時(shí)間、產(chǎn)品質(zhì)量等方面，確定了酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉比發(fā)酵法生產(chǎn)效果好。

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