閆炳雄，許文迪，賀 帥，邱智東，王偉楠*

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

三七（Panax notoginseng）又名田七，為五加科人參屬多年生草本植物的根莖，是傳統(tǒng)名貴中藥材之一，具有化瘀止痛，活血定痛的功效，對(duì)出血癥，跌打損傷，瘀血腫痛，虛損勞傷等病癥療效顯著?，F(xiàn)代研究表明三七的主要活性物質(zhì)為皂苷類(lèi)成分。其藥理作用主要包括對(duì)心腦血管的影響、對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響、對(duì)血液的影響、對(duì)免疫系統(tǒng)的影響和抗腫瘤等方面[1-8]。三七中皂苷含量為6%，遠(yuǎn)高于其他五加科植物的總皂苷含量[9]，但活性和生物利用度較好的稀有皂苷類(lèi)成分如人參皂苷Rd，Rh1，Rh2，Rg3，CK等含量極少，甚至不可檢出，因此如何提高稀有皂苷含量成為了三七深度開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵問(wèn)題。

應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)提高中藥活性成分含量，改變物質(zhì)基礎(chǔ)組成是中藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容，因其效率高、無(wú)污染，具有較好的應(yīng)用前景。中藥材經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵之后，化學(xué)成分發(fā)生了明顯的變化，某些大分子降解成小分子，易于被人體吸收，提高藥材生物利用度；某些藥物增加了有效成分或有效部位的含量，改善了藥效[10-16]。黑曲霉（Aspergillusniger）是環(huán)境中的常見(jiàn)菌種，生長(zhǎng)速度快，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，且生物安全性較高，非常適用于在中藥基質(zhì)上生長(zhǎng)。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑曲霉在潮濕的三七藥材中很容易生長(zhǎng)。所以本研究利用黑曲霉對(duì)三七藥材進(jìn)行固體發(fā)酵，采用高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquidchromatography-quadrupole-timeofflight-tandemmass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS/MS）方法，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中主要活性成分皂苷含量的變化進(jìn)行檢測(cè)，為三七藥材的開(kāi)發(fā)和利用及相關(guān)藥物研究提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

三七藥材購(gòu)于吉林國(guó)安藥業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、麥芽浸膏、馬鈴薯浸出粉（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；七水合硫酸鎂、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硝酸鈉甲醇均為分析純：北京化工廠；乙腈、甲酸均為色譜純：美國(guó)Thermo Fisher公司。人參皂苷Rb1（批號(hào)：MUST-12102301）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：MUST-13041301）、人參皂苷Rd（批號(hào)：MUST-15020910）、人參皂苷Rh1（批號(hào)：MUST-15020914）、人參皂苷Rh2（批號(hào)：MUST-14062410）、人參皂苷CK（批號(hào)：MUST-15012711）、人參皂苷Rg3（批號(hào)：MUST-14041211）、人參皂苷F1（批號(hào)：MUST-14101610）標(biāo)品：成都曼斯特生物科技有限公司；人參皂苷F2（批號(hào)：GR-133-131224）、三七皂苷R1（批號(hào)：GR-133-131109）、三七皂苷R2（批號(hào)：GR-133-131209）標(biāo)品：南京廣潤(rùn)生物制品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。自然pH，121℃滅菌20 min。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。自然pH，121℃滅菌20 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：粉碎三七藥材粉末（過(guò)10目篩），1.5%CaCO3，加入50%的蒸餾水，攪拌均勻121℃滅菌60 min。

1.1.4 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）CICC 2124：中國(guó)工業(yè)菌種保藏管理中心，PDA培養(yǎng)基斜面4℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent 6520 Q-TOF質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司；DZX180微生物培養(yǎng)箱：上海艾測(cè)電子科技有限公司；ZD-88恒溫冷凍振蕩器、HSP150B恒溫恒濕培養(yǎng)箱：金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；TG328A（S）分析天平：北京斯達(dá)恒通科技有限公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BPZ-6930LC真空干燥箱：上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器總廠；FW177中草藥粉碎機(jī)：天津市泰特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的復(fù)壯、復(fù)蘇及種子液的制備

將黑曲霉斜面從低溫冷藏冰箱中取出，迅速移至30℃水浴中加熱30 min后，擦干試管表面，將斜面放置在28℃的微生物培養(yǎng)箱中12 h后，即可取出備用。將復(fù)蘇的黑曲霉菌于液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)5 d，即得液體種子培養(yǎng)基。

1.3.2 菌體培養(yǎng)

取三七藥材粉碎（過(guò)10目篩），加入0.5%無(wú)機(jī)鹽CaCO3，加入50%的蒸餾水，攪拌均勻，分裝于250 mL廣口三角瓶中，密塞瓶口，放入高壓蒸汽滅菌器中保持溫度121℃，滅菌60 min，取出，自然冷卻至室溫，在生物安全柜中接種黑曲霉菌液適量，待接種完成后放入溫度為28℃，相對(duì)濕度65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 d。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物供試品及對(duì)照樣品的制備

將發(fā)酵至終點(diǎn)的發(fā)酵物從培養(yǎng)瓶中取出，置于減壓真空干燥箱60℃干燥，用中草藥粉碎機(jī)粉碎。取本品粉末（過(guò)65目篩）0.2 g，精密稱定，精密加入甲醇4 mL，稱質(zhì)量，超聲（150 W，40 kHz）處理1 h，冷卻后再稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾器過(guò)濾，作為供試品溶液。同法制得三七藥材對(duì)照品溶液。

皂苷含量變化計(jì)算公式如下：

1.3.4 液相色譜-質(zhì)譜分析

（1）高效液相色譜條件

采用ZORBAXSB-Aq色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的程序進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min。

表1 三七發(fā)酵產(chǎn)物高效液相色譜洗脫梯度Table 1 HPLC chromatographic elution condition ofPanax notoginsengfermentation product

（2）質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electronic sprayion，ESI）；電離模式：負(fù)離子模式；噴霧器壓力：207kPa；干燥氣（N2）流速：10L/min；干燥氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：3500V；碎裂電壓：175V；錐孔電壓：65 V；質(zhì)量檢測(cè)范圍：300～1 400 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜峰歸屬

三七混標(biāo)溶液及固體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析，其液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析得到的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1，各組分鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

由圖1和表2可知，三七藥材經(jīng)黑曲菌固體發(fā)酵后主要活性成分發(fā)生較大變化。根據(jù)分子量和結(jié)構(gòu)裂解規(guī)律，推斷1～13號(hào)色譜峰均為皂苷類(lèi)成分。經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，色譜峰1、2、3、4、5、6、11、12、13分別鑒定為三七皂苷R1（notoginsenoside R1）、人參皂苷Rg1、三七皂苷R2（notoginsenoside R2）、人參皂苷Rh1、F1、Rd、F2、Rg3、CK；7號(hào)峰的[M-H]m/z=751.469 4計(jì)算分子式為C41H68O12，初步推測(cè)為三七皂苷T5（notoginsenoside T5）；8、9、10號(hào)峰的[M-H]m/z值分別為619.432 9、619.432 4、619.432 3，計(jì)算分子式均為C36H60O8，為三個(gè)同分異構(gòu)體，結(jié)合目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道，初步推測(cè)為人參皂苷Rk3、Rh4和Rh16。

圖1 混標(biāo)(A)和發(fā)酵產(chǎn)物(B)的皂苷化合物分析LC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC)of the mixed standards(A)and fermentation product(B)for saponin compounds analysis by LC-MS

表2 色譜峰鑒定Table 2 Identification of the chromatographic peaks

2.2 三七藥材發(fā)酵前后主要皂苷類(lèi)成分的含量變化

對(duì)三七藥材及固體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析，其LC-MS分析得到的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用的定量模式，記錄不同色譜峰發(fā)酵前后的峰面積變化，三七藥材及三七發(fā)酵產(chǎn)物皂苷峰面積對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 三七發(fā)酵前(A)及發(fā)酵后(B)的皂苷化合物分析的LC-MS總離子色譜流圖Fig.2 TIC of saponin compounds ofPanax notoginsengbefore(A)and after(B)fermentation for saponin compounds analysis by LC-MS

表3 三七藥材及發(fā)酵產(chǎn)物皂苷峰面積對(duì)比Table 3 Peak areas of different saponins inPanax notoginseng and the fermentation products

由圖2及表3可知，三七經(jīng)過(guò)發(fā)酵之后，原生苷的含量均有不同程度的降低，而極性較低的稀有皂苷含量均有大幅度的提高。通過(guò)計(jì)算，原藥材中含量較高的人參皂苷Rb1幾乎全部轉(zhuǎn)化生成其他物質(zhì)，在發(fā)酵產(chǎn)物中已不可檢出；人參皂苷Rg1的含量也有較大幅度的降低，經(jīng)計(jì)算為62.19%；而三七皂苷R1的含量變化不大，僅降低了3.87%；三七皂苷R2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rk3的含量分別提高484.65%、1513.57%、121.98%、21.20%、208.73%；并且產(chǎn)生了生物利用度更好的稀有皂苷類(lèi)成分人參皂苷F1、人參皂苷Rh4、三七皂苷Rh16、三七皂苷T5、人參皂苷Rg3和人參皂苷CK，推測(cè)均為生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

3 結(jié)論

黑曲霉是工業(yè)上常用的發(fā)酵菌種，具有遺傳系統(tǒng)穩(wěn)定，生長(zhǎng)迅速，酶系豐富等特點(diǎn)，其中尤以糖苷酶較為豐富，因此，利用黑曲霉對(duì)皂苷類(lèi)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造具有良好的發(fā)展前景。在本實(shí)驗(yàn)中，三七藥材經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，皂苷類(lèi)成分產(chǎn)生了顯著的變化，利用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其中主要的皂苷進(jìn)行了鑒定，然后通過(guò)查閱大量三七藥材及其加工產(chǎn)品的成分分析文獻(xiàn)[17-22]，對(duì)另外幾個(gè)皂苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、極性大小和在ZORBAX反相色譜柱上的相對(duì)保留時(shí)間，進(jìn)行歸納總結(jié)，最終判斷7號(hào)峰為三七皂苷T5，8號(hào)峰為人參皂苷Rk3，9號(hào)峰為人參皂苷Rh4，10號(hào)峰為人參皂苷Rh16；通過(guò)比較發(fā)酵前后三七藥材的活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)藥理活性和生物利用度更好的稀有皂苷含量明顯增加，使得到的發(fā)酵產(chǎn)物展現(xiàn)出較高的臨床應(yīng)用價(jià)值和挖掘潛力，為指導(dǎo)三七藥材的開(kāi)發(fā)和利用以及稀有皂苷的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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