任 荔，陶偉偉，薛文達(dá)，吳顥昕,陳 剛

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心、2.中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

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越鞠丸石油醚部位潛在的快速抗抑郁作用與BDNF、TrkB蛋白表達(dá)的上調(diào)相關(guān)

任 荔1,2，陶偉偉1,2，薛文達(dá)1,2，吳顥昕1,2,陳 剛1,2

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心、2.中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

目的 研究越鞠丸石油醚部位是否具有快速抗抑郁潛力，并對其有效劑量及潛在的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了探討。方法 將44只昆明種♂小鼠隨機(jī)分成空白組(生理鹽水組)、越鞠丸石油醚部位(YJ-PE)高、中、低劑量組及氯胺酮組。單次給藥后30 min對昆明小鼠進(jìn)行小鼠懸尾行為絕望測試。再將24只昆明種♂小鼠分成空白組、篩選出有效的越鞠丸石油醚部位低劑量組和氯胺酮組，單次給藥24 h后進(jìn)行小鼠懸尾行為絕望測試。利用Western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測給藥后30 min及24 h小鼠海馬區(qū)BDNF和TrkB蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果 單次給藥越鞠丸石油醚部位從30 min到24 h均能對其小鼠懸尾的行為絕望行為產(chǎn)生抗抑郁作用。給予越鞠丸石油醚部位30 min后小鼠海馬中的BDNF及其受體TrkB的表達(dá)明顯上調(diào)，且這種抗抑郁的作用機(jī)制可持續(xù)到24 h。結(jié)論 越鞠丸石油醚部位(低劑量)具有快速抗抑郁的藥物潛力，且這種潛在的快速抗抑郁作用與BDNF及其受體TrkB的激活相關(guān)。

越鞠丸;石油醚部位;快速抗抑郁;BDNF;TrkB;氯胺酮

抑郁癥以情緒低落、悲觀、睡眠障礙，嚴(yán)重者常伴有自殺念頭或行為特點(diǎn)的情志疾病[1]。世界衛(wèi)生組織聯(lián)合中國精神疾病防治協(xié)會研究表明,在我國抑郁癥患病人數(shù)超過6 100萬，成為國民疾病負(fù)擔(dān)第二的疾病，具有極高的致殘性和致死性，嚴(yán)重危害國民健康[2]。然而由于本病的復(fù)雜性，至今仍不能完整全面的闡釋其發(fā)病機(jī)制，且一線西醫(yī)藥物的局限性和副作用都很突出。目前臨床上以5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)重?cái)z取抑制劑為代表的單胺增強(qiáng)類藥物是主流抗抑郁藥物，但據(jù)統(tǒng)計(jì)，三分之一病人對各種單胺增強(qiáng)類藥物沒有反應(yīng)性，而有反應(yīng)性的病人中有50%的人群臨床癥狀改善后會復(fù)發(fā)。除此以外，這些常規(guī)抗抑郁藥還有起效緩慢的缺點(diǎn)，通常需要服用3-6個(gè)星期的時(shí)間后才能顯示出效果[3]。顯效遲滯性導(dǎo)致抑郁癥病人服藥的依從性低，往往提前中斷用藥，也會因此推遲服用其他或許有效的抗抑郁藥物，尤其不利于治療有高自殺風(fēng)險(xiǎn)的抑郁癥病人[4-5]。因此，快速有效地緩解抑郁癥狀成為抑郁癥治療中一個(gè)迫切需要解決的重要問題。

傳統(tǒng)中藥方劑越鞠丸，功用行氣解郁，主治郁證。始載于元代著名醫(yī)家朱震亨《丹溪心法》中: “越鞠丸，解諸郁”。方由蒼術(shù)、香附、川芎、神曲、梔子五味藥組成。能解氣、血、濕、熱、食、痰等諸郁。越鞠丸在現(xiàn)當(dāng)代也多被用于抑郁癥的治療。Xue等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，醇提越鞠丸具有快速抗抑郁的作用。Wei等[7]的研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸石油醚部位為包含了越鞠丸活性成分的部位，并認(rèn)為該部位具有抗抑郁作用。然而之前的研究并未解釋越鞠丸石油醚部位是否為越鞠丸的快速起效抗抑郁部位。本研究試圖解答越鞠丸石油醚部位是否具有快速抗抑郁的潛力，并對其生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行相應(yīng)探討，為之后具有快速抗抑郁作用的相關(guān)中醫(yī)藥開發(fā)打下初步的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康昆明種小鼠68只，體質(zhì)量20～25 g，♂，由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物合格證號：SCXK-(軍)2012-0004。動物房室溫25℃，濕度45%，晝夜交替12 h,動物自由飲食進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物越鞠丸全方由香附、梔子、川芎、蒼術(shù)、神曲5藥組成，按1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1比例配伍。實(shí)驗(yàn)用中藥材購于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診。取5種藥材粉碎1 kg，過100目篩，等量混合后浸泡在95%乙醇中(6倍體積)24 h，期間不停攪拌。靜置后取上清，同樣過程重復(fù)2次，收集3次的上清液后過濾，減壓濃縮至無乙醇。濃縮浸膏采用水混懸，用石油醚萃取5次，合并石油醚萃取液并減壓回收至干，得到石油醚萃取部位。鹽酸氯胺酮(ketamine,Ket)注射液為福建古田制藥廠生產(chǎn)(批號：20140301)。使用時(shí)用0.9%生理鹽水配成30 g·L-1的藥液[6]。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器主要儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南鞏義矛華儀器設(shè)備有限公司)，攝像機(jī)(Panasonic),小鼠懸尾視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件公司)，Nanodrop 2000(Thermo), 蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad);凝膠成像及分析系統(tǒng)(Tannon)

主要試劑：RIPA裂解液:Beyotime，貨號：P0013B；蛋白酶抑制劑Cocktail: CellSignaling Technology, 貨號：#5871S；蛋白Marker:貨號：Thermo,批號：00222891；一抗：均為兔抗小鼠，BDNF (Santa Cruz, sc-546, 1 ∶200), TrkB (Cell Signaling Technology, 4603P, 1 ∶1 000), β-tubulin (Epitomics, 1879-1, 1 ∶2 000)；二抗：中杉金橋羊抗兔，批號：109525；ECL顯色液：康為世紀(jì)，批號：2514K。

2 方法

2.1 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)

2.1.1 分組與給藥 30 min測試：44只♂小鼠均分為空白組與YJ-PE高、中(即越鞠丸醇提物有效劑量[6])、低劑量(20、13.5、6.75 g·kg-1)組以及氯胺酮組(30 mg·kg-1)。灌胃，30 min給藥結(jié)束后進(jìn)行小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)。

24 h測試：24只♂小鼠均分為空白組與YJ-PE低劑量組(6.75 g·kg-1)以及氯胺酮組(30 mg·kg-1)。灌胃，24 h給藥結(jié)束后進(jìn)行小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 行為學(xué)測試 將單個(gè)小鼠尾端(距尾1 cm處) 用膠布粘在懸掛鉤上面，放入通用隔音箱內(nèi)，使其成倒掛狀態(tài)，頭部離箱底20 cm。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動，但活動一段時(shí)間出現(xiàn)間斷性不動，顯示絕望狀態(tài)。觀察6 min，記錄后4 min 內(nèi)小鼠不動時(shí)間為絕望時(shí)間。

Fig 1 Immobility time of mice in tail suspension test(n=8-9)

1:Control; 2:YJ-PE 6.75 g·kg-1; 3: YJ-PE 13.5 g·kg-1; 4:YJ-PE 20 g·kg-1; 5:Ket 30 mg·kg-1，*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 Immobility time of mice in forced swimming test(n=8)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2 Western blotWestern blot檢測BDNF及TrkB水平,提取小鼠海馬蛋白，用Nanodrop測定樣品中蛋白濃度。根據(jù)BDNF和TrkB的分子量選擇SDS-PAGE膠(分別為15%和8%的膠)電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，將PVDF膜放入一抗封閉緩沖液中室溫?fù)u床震蕩1h，然后分別加有BDNF、TrkB、Tubulin抗體的抗體盒中，4℃過夜。TBST緩沖液漂洗3次，將PVDF膜分別放入加有羊抗兔二抗的抗體盒中，室溫孵育1h，ECL顯影。采集BDNF、TrkB及Tubulin條帶灰度值，得到各樣本BDNF、TrkB與Tubulin的灰度比值。

3 結(jié)果

3.1 給予越鞠丸石油醚部位3個(gè)劑量30 min后對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的影響給藥30 min后YJ-PE低劑量組在小鼠懸尾上不動時(shí)間與空白組相比明顯降低(P<0.01)； YJ-PE中劑量組與空白組相比差異無顯著性；YJ-PE高劑量組與空白組相比不動時(shí)間明顯延長(P<0.01)。Ket與空白組相比不動時(shí)間明顯降低(P<0.05)。YJ-PE低劑量組與Ket相比差異無顯著性，見Fig 1。

3.2 給予低劑量越鞠丸石油醚部位24 h后對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的影響給藥24 h后，YJ-PE低劑量組在小鼠懸尾上不動時(shí)間與空白組相比明顯降低(P<0.01)；Ket組與空白組相比明顯降低(P<0.05),見Fig 2。

Fig 3 BDNF and TrkB expressions at 30min(n=7)*P<0.05, **P<0.01 vs control

Fig 4 BDNF and TrkB expressions at 24h(n=7)*P<0.05, **P<0.01 vs control

3.3 給藥30 min后,小鼠海馬BDNF及TrkB的Western blot檢測結(jié)果給藥30 min后，YJ-PE組和Ket與空白組相比，小鼠海馬BDNF的表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；與空白組相比，YJ-PE組和Ket組小鼠海馬TrkB的表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見Fig 3。

3.4 給藥24 h后小鼠海馬BDNF及TrkB的Western blot檢測結(jié)果給藥24 h后，YJ-PE組和Ket與空白組相比，小鼠海馬BDNF的表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；與空白組相比，YJ-PE組和Ket組小鼠海馬TrkB的表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，見Fig 4。

4 討論

相對于傳統(tǒng)的SSRI而言，快速抗抑郁藥物能短時(shí)間內(nèi)對抑郁癥病人產(chǎn)生抗抑郁的效果。而氯胺酮為目前研究較多的快速抗抑郁藥物。在臨床上及動物模型中都顯示出快速性。氯胺酮是腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)的拮抗劑。臨床研究發(fā)現(xiàn)，單次注射小劑量氯胺酮，可對超過七成病人起到快速抗抑郁作用，同時(shí)超過35%的病人反映其抗抑郁作用可以維持兩周[8]。動物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，單次低劑量的氯胺酮導(dǎo)致快速持久的抗抑郁作用[9-10]?？焖倏挂钟羲幬锸褂玫臋z驗(yàn)?zāi)Ｐ团c傳統(tǒng)抗抑郁模型一致，包括懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test, TST)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test,FST)等行為絕望、在習(xí)得性無助(learned helplessness,LH)上的失敗逃脫次數(shù)和慢性不可預(yù)知輕微應(yīng)激(chronic unpredictable mild Stress, CUMS)造模后形成的糖偏好，陌生環(huán)境攝食(novelty suppressed-feeding，NSF)等抑郁樣行為[11]，但強(qiáng)調(diào)單次給藥后產(chǎn)生的抗抑郁作用包括其作用的持久性。雖然氯胺酮具有快速抗抑郁作用，然而成癮性、肝毒性、神經(jīng)毒性等副作用限制了其臨床應(yīng)用范圍[12-13]。目前臨床尚沒有具有快速抗抑郁效果，且毒副作用較低的西藥。

中醫(yī)治療情志病歷史悠久，有關(guān)“郁證”的臨床表現(xiàn)與現(xiàn)代抑郁癥十分相似。其中越鞠丸是治療郁證的經(jīng)典方劑。著名醫(yī)家蒲輔周先生曾云：“郁之為病，人多忽視，多以郁為虛，惟丹溪首創(chuàng)五郁六郁之治，越鞠丸最好”。有若干中醫(yī)臨床案例報(bào)道提示越鞠丸具有較快起效抗抑郁作用[14-16]。雖然部分報(bào)道尚缺乏系統(tǒng)性研究，但共同提示越鞠丸具有臨床快速起效抗抑郁的作用。我們前期使用快速抗抑郁的研究方法，也揭示了越鞠丸作為中藥復(fù)方的快速抗抑郁作用[6,17]。

Wei等[7]在越鞠丸中提取出石油醚部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位及水部位4個(gè)部位來篩選出越鞠丸中抗抑郁的主要活性成分，發(fā)現(xiàn)越鞠丸的主要活性成分包含在石油醚部位和正丁醇部位2個(gè)部位中。其中石油醚部位的抗抑郁活性要高于正丁醇部位。本研究中小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果支持越鞠丸石油醚部位具有快速起效抗抑郁潛力。小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)是常用的篩選抗抑郁藥物的評價(jià)模型[18]。小鼠被置于不可逃脫的環(huán)境中時(shí)，會出現(xiàn)拼命掙扎，試圖逃脫的行為，在經(jīng)過努力仍不能擺脫困境后，小鼠會表現(xiàn)出間斷性不動的“行為絕望”狀態(tài)。這種狀態(tài)被認(rèn)為某種程度模擬了抑郁癥的表現(xiàn)[19]。絕大多數(shù)的抗抑郁藥物均可縮短小鼠的不動時(shí)間[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，單次給藥30 min后，與空白組相比，低劑量YJ-PE明顯縮短小鼠的懸尾不動時(shí)間, 高劑量YJ-PE明顯延長了小鼠的懸尾不動時(shí)間，而中劑量YJ-PE的小鼠懸尾不動時(shí)間差異無顯著性。24 h后再次使用低劑量YJ-PE進(jìn)行小鼠懸尾測試，其抗抑郁作用依然存在，表明該劑量的持久抗抑郁作用，也與越鞠丸醇提物的效應(yīng)相似[6]。這表明低劑量YJ-PE給藥可能具有快速抗抑郁潛力，中劑量YJ-PE給藥則沒有快速抗抑郁作用，而高劑量YJ-PE給藥反而可能導(dǎo)致抑郁樣反應(yīng)。高劑量YJ-PE的致抑郁樣反應(yīng)，可能與越鞠丸中一些藥物成分在大劑量給藥時(shí)出現(xiàn)的較為明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用有關(guān)[21-22]。

大量的文獻(xiàn)表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)及其受體酪氨酸蛋白激酶B(Tropomyosin receptor kinase B，TrkB)在抑郁癥的發(fā)病中扮演著相當(dāng)重要的角色。BDNF及其特異性受體TrkB廣泛分布于大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)域,對神經(jīng)元的生存、生長、分化維持神經(jīng)元功能和再生修復(fù)等多方面具有重要影響[23]。有研究表明，海馬BDNF mRNA和蛋白水平的降低與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)[24]。而BDNF通過與TrkB的特異結(jié)合，激活海馬內(nèi)一系列細(xì)胞內(nèi)信號，從而發(fā)揮其抗抑郁效應(yīng)[25]。Autry等[26]的研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮可能通過快速降低eEF2 磷酸化水平，去除對BDNF翻譯的抑制，快速增加BDNF合成，增強(qiáng)突觸應(yīng)答來實(shí)現(xiàn)快速抗抑郁作用。有報(bào)道認(rèn)為[27-28]，BDNF和TrkB同樣參與了快速抗抑郁藥物氯胺酮的快速起效作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)急性給藥YJ-PE 30 min和24 h后，昆明小鼠海馬中的BDNF和TrkB蛋白表達(dá)明顯升高。神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的增加可通過提高神經(jīng)可塑性而產(chǎn)生抗抑郁作用[29]。因此，YJ-PE可能通過快速增加BDNF及其特異性受體TrkB的表達(dá)來快速增加神經(jīng)營養(yǎng)以及神經(jīng)可塑性，從而起到快速抗抑郁的作用。

本研究結(jié)果提示，YJ-PE快速抗抑郁的量效關(guān)系可能與越鞠丸醇提物相似，具有一個(gè)較為狹窄的快速抗抑郁有效劑量范圍[6]。但其有效劑量范圍有所不同。這種特殊的有效劑量依賴性背后的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制值得進(jìn)一步研究,以拓展該方劑的臨床應(yīng)用，夯實(shí)后續(xù)藥物開發(fā)的基礎(chǔ)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心與中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝。)

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Potent rapid antidepressant effects of petroleum ether fraction of Yueju pill associated with BDNF and TrkB up-regulation

REN Li1, 2, TAO Wei-wei1, 2, XUE Wen-da1, 2, WU Hao-xin1, 2, CHEN Gang1, 2

(1.CenterforTranslationalSystemsandNeuroscience,SchoolofBasicBiomedicalScience; 2.KeyLaboratoryofIntegrativeBiomedicineofBrainDiseases,SchoolofBasicBiomedicalScience,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Aim To identify whether the petroleum ether fraction of Yueju pill (YJ-PE) could exhibit a potent rapid antidepressant effect and to investigate the underlying biological mechanism involved. Methods Fourty-four male KM mice were randomly assigned to five groups： the control group (saline group), low dosage of YJ-PE, middle dosage of YJ-PE, high dosage of YJ-PE and ketamine. After a single drug administration, we used tail suspension test (TST) to test the rapid antidepressant effect of YJ-PE in KM mice at 30 min. Another twenty-four male KM mice were assinged to three groups: control group, screened effective low dosage of YJ-PE group and ketamine group. We usd TST to assess these mice at 24 h post a single administration. Western blot was performed to examine the expression of BDNF and TrkB in hippocampus of KM mice at 30 min and 24 h post a single administration. Results An acute administration of YJ-PE decreased the immobility time of KM mice in TST and increased the expression of BDNF and TrkB as soon as 30min post a single administration and lasted at least for 24 hours. Conclusion YJ-PE (low dosage) exhibits a rapid antidepressant-like potent, and the potent rapid antidepressant effects of YJ-PE are associated with the up-regulation of BDNF and TrkB.

Yueju pill; petroleum ether fraction; rapid antidepressant; BDNF; TrkB; ketamine

時(shí)間：2015-11-24 11:00 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20151124.1100.050.html

2015-07-27,

2015-09-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81403041)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No BK20151568);江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科支持項(xiàng)目

任 荔(1988-)，女，博士生，研究方向：越鞠丸治療抑郁癥的機(jī)制,E-mail：nicolight@163.com; 陶偉偉(1984-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中醫(yī)藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),E-mail：tw845@163.com; 陳 剛(1972-)，男，博士，特聘教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抑郁癥的中醫(yī)藥機(jī)制，通訊作者，Tel:025-85811160,E-mail：chengang@njucm.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.12.025

A

1001-1978(2015)12-1754-06

R-332；R284.1；R322.81；R749.42；R971.43；R977.6