郭勇英,張軍芳,賈存勤,高懷林

(1. 河北省絡病重點實驗室, 河北 石家莊 050035; 2. 河北以嶺醫(yī)藥研究院,河北 石家莊 050035;3. 河北醫(yī)科大學附屬以嶺醫(yī)院, 河北省中醫(yī)藥絡病理論指導糖尿病足防治重點研究室, 河北 石家莊 050091)

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◇復方藥物藥理學◇

通心絡聯(lián)合外周血間充質干細胞移植對糖尿病足大鼠血管新生HIF-1/VEGF通路及miR-210表達的影響

郭勇英1,張軍芳2,賈存勤2,高懷林3

(1. 河北省絡病重點實驗室, 河北 石家莊 050035; 2. 河北以嶺醫(yī)藥研究院,河北 石家莊 050035;3. 河北醫(yī)科大學附屬以嶺醫(yī)院, 河北省中醫(yī)藥絡病理論指導糖尿病足防治重點研究室, 河北 石家莊 050091)

目的 探討通心絡聯(lián)合外周血間充質干細胞移植治療對糖尿病足大鼠血管新生HIF-1/VEGF通路及miR-210表達的影響。方法 將70只♂ Sprague-Dawley大鼠進行高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素注射建立糖尿病大鼠模型，成模大鼠結扎右下肢股動、靜脈制造糖尿病足模型，以同批次正常大鼠復制下肢缺血模型為對照組，造模大鼠隨機分成6組：模型組、通心絡組、西洛他唑組、干細胞組、通心絡聯(lián)合干細胞組、西洛他唑聯(lián)合干細胞組，分別給予治療干預28 d后麻醉，腹主動脈取血，離心取上清，酶聯(lián)免疫吸附測定VEGF-A和HIF-1α；大鼠缺血肢肌組織分別采用Western blot檢測VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達和RT-PCR檢測VEGF-A基因表達。結果 檢測結果顯示：與對照組比較，模型組VEGF-A、HIF-1α、VEGF-R2和miR-210表達明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組VEGF-A、VEGF-R2和miR-210表達均明顯升高(P<0.01)，其中通心絡聯(lián)合干細胞組VEGF-A、HIF-1α、VEGF-R2和miR-210表達高于通心絡組、西洛他唑組及干細胞組(P<0.05，P<0.01)。結論 通心絡聯(lián)合外周血間充質干細胞移植可能通過調節(jié)HIF-1/VEGF通路及miR-210表達，促進內皮細胞增殖、分化，促進新生血管形成。

外周血間充質干細胞；移植；通心絡；西洛他唑；糖尿病足大鼠模型；血管新生；HIF-1/VEGF通路

糖尿病足是糖尿病最嚴重的和治療費用最高的慢性并發(fā)癥之一，重者可導致截肢，下肢截肢的相對風險是非糖尿病患者的40倍[1]。隨著干細胞移植技術在再生醫(yī)學的不斷發(fā)展，應用干細胞移植正成為治療糖尿病足的新方法，近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]，干細胞移植到缺血組織內分化成內皮細胞(endothelial cell, ECs)，直接形成新的血管，又可通過旁分泌血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、血管生成素-2、血管生成素-1等多種血管生成因子來參與血管的新生。且研究發(fā)現(xiàn)通心絡可以通過改善心肌梗死區(qū)微環(huán)境，增加干細胞移植后存活[3]，增加新生血管、建立側枝循環(huán)，增加糖尿病足缺血下肢血流灌注量[4]。因此，本實驗就通心絡聯(lián)合外周血間充質干細胞移植治療糖尿病足大鼠促進其缺血下肢血管生成中的作用進行研究，以探討其涉及的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SPF級♂ SD大鼠70只，4周齡，體質量190～230 g，動物合格證號：SCX K(京)2009-0017，由中國食品藥品檢定研究院提供，同源異體供體大鼠為清潔級♂ SD大鼠10只，15周齡，約300 g左右，許可證號：SCXK(京)2009-0007，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。飼養(yǎng)在河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理實驗室，光照12 h·d-1，溫度22～24℃，相對濕度50%～70%，每日正常飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物通心絡原粉(由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成，每克含1.47 g生藥，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號20120924)用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制，4℃保存。

西洛他唑片(浙江大冢制藥有限公司，批號130801P)用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液現(xiàn)配。

1.3 實驗試劑鏈脲佐菌素(STZ，美國Amresco公司，批號：1262C443)，重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF，深圳新鵬生物工程有限公司，批號：201302009)，細胞處理試劑盒(河北博海生物工程開發(fā)有限公司，批號：20140428)，CD90、CD105、CD49A、CD49B、CD49C、CD29、CD104磁珠(德國美天旎公司，批號：30.APR.2013)， CD105-FITC、CD44-FITC、CD34-FITC(德國美天旎公司，批號：30.APR.2013)，4、6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI，河北博海生物工程開發(fā)有限公司，批號：20130808)，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，批號F15647)，血管內皮生長因子A(VEGF-A)試劑盒(上海森威科技有限公司，批號1407065)，VEGF-A Rabbit polyclonal IgG(ab183100，英國Abcam公司)，VEGF-R2 Rabbit polyclonal IgG(ab39256，英國Abcam)

1.4 設備與器材AL204精密分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，干細胞磁性分選架、分選器、分選柱(德國美天旎公司)，逆轉錄酶(M-MLV)、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、dNTP、Taq DNA polymerase、隨機引物(Random primers)(美國Promega公司)，熒光定量PCR試劑盒(美國BBI公司)，170-930型電轉膜儀、170-3940型半干轉膜儀、165-8001型垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)

1.5 方法

1.5.1 大鼠外周血間充質干細胞(Peripheral blood derived mesenchymal stem cells, PB-MSCs)分離 10只清潔級♂ SD大鼠,每日皮下注射G-CSF 50 μg·kg-1，連續(xù)5 d，d 6全麻下腹主動脈用含有肝素抗凝管采血10 mL，密度梯度離心分離外周血單核細胞，確定細胞數(shù)量，重新懸浮細胞后加入CD90/CD105/CD49a/CD49b/CD49c/CD29/CD104微珠、混勻、孵育、離心，棄上清。用MS柱放于MACS分選器磁鐵部位，將細胞懸液加到柱子中，收集通過柱子陰性的細胞。將分選柱與分選磁鐵分離，沖洗掉柱子中帶磁性標記的細胞，收集得到的是目的細胞即干細胞。加入0.1 mL無菌的DAPI溶液染色。用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至4 mL(干細胞濃度0.5～2.0×109·L-1)，冰上保存，計數(shù)細胞數(shù)，收集干細胞，以備移植。

1.5.2 模型制備 參照文獻[5-6]的造模方法并進行改進。造模大鼠采用高脂喂養(yǎng)(熱量配比：脂肪59.8%，碳水化合物20.1%，蛋白質20.1%)8周，禁食16h后腹腔注射STZ(35 mg·kg-1)，正常對照組注入同體積的檸檬酸鈉緩沖溶液，72 h后測尾尖血糖在16.7 mmol·L-1以上者入選為糖尿病模型。入模組和對照組大鼠于10%水合氯醛腹腔注射麻醉下，仰臥固定備皮消毒后，縱行切開右側腹股溝正中皮膚，于腹股溝下分離出股動脈和股靜脈，結扎并剪斷股動脈和股靜脈，傷口局部涂撒青霉素，縫合皮膚。

1.5.3 分組及給藥 將糖尿病足大鼠隨機分為模型組、通心絡組(TXL)、西洛他唑組(cilostazol)、外周血間充質干細胞組(干細胞組, PB-MSCs)、通心絡聯(lián)合外周血間充質干細胞組(通心絡聯(lián)合干細胞組, T-MSCs)、西洛他唑聯(lián)合外周血間充質干細胞組(西洛他唑聯(lián)合干細胞組, C-MSCs)，每組10只，對照組(單純手術組,n=10)、模型組和干細胞組大鼠以等體積的生理鹽水灌胃，通心絡組和通心絡聯(lián)合干細胞組給予通心絡0.4 g·kg-1，1 次/天灌胃，西洛他唑組和西洛他唑聯(lián)合干細胞組給予西洛他唑18 mg·kg-1，1 次/天灌胃；干細胞組、通心絡聯(lián)合干細胞組及西洛他唑聯(lián)合干細胞組術后3 d沿股動脈走向、多點肌肉注射給予干細胞移植1.0×109·L-1，對照組、模型組、通心絡組和西洛他唑組同點肌肉注射等體積無菌RPMI1640培養(yǎng)基。

1.6 觀察項目

1.6.1 大鼠血清VEGF-A和HIF-1α水平檢測 取出凍存血清樣品，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清VEGF-A和HIF-1α水平，嚴格參照試劑盒說明書操作，設立標準品濃度，酶標儀自動擬合標準曲線，通過檢測待測孔OD值，得到樣本VEGF-A和HIF-1α含量。

1.6.2 RT-PCR方法測定VAGF-A mRNA的表達 參照文獻[7]，實驗結束后處死大鼠，取缺血下肢肌組織，提取總RNA，按試劑盒說明加樣進行逆轉錄反應，熒光定量qPCR儀擴增。引物合成：VEGF-A(145bp)：上游5′-TGCTCCTTCACTCCCTCAAAT-3′，下游5′-TGTCCCTCTCTCTGTTCGCT-3′；內參照β-actin(105 bp)：上游5′-GGTCATCACCATTGGCAA-3′，下游5′-GAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3′。用儀器自帶的分析軟件，將對照組設定為1，以相對定量值RQ用于統(tǒng)計分析。

1.6.3 Western blot法檢測VEGF-A和VEGF-R2蛋白的表達 實驗結束后處死大鼠，稱取大鼠缺血下肢肌組織加入組織裂解液，勻漿后4℃離心分離上清，進行蛋白定量。取各組蛋白樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜后封閉，與一抗結合后洗膜，二抗結合，洗膜后采用增強型ECL化學發(fā)光法顯色，掃描灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH比值表示。

2 結果

2.1 各組大鼠血清VEGF-A和HIF-1α水平比較與對照組比較，模型組血清VEGF-A和HIF-1α水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組血清VEGF-A水平均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，T-MSCs和C-MSCs血清HIF-1α水平明顯升高(P<0.01)。T-MSCs和C-MSCs血清HIF-1α水平高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P<0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Comparison of VEGF-A and HIF-1α in rat serum in different groups(±s,n=10)

**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel;#P<0.05vsTXL;▲P<0.05vsCilostazol;○P<0.05vsPB-MSCs

2.2 各組大鼠缺血下肢肌組織中VEGF-A和miR-210 mRNA表達比較與對照組比較，模型組肌組織中VEGF-A和miR-210 mRNA表達明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組肌組織中VEGF-A和miR-210 mRNA表達均明顯升高(P<0.01)。各用藥組組間比較，T-MSCs肌組織中VEGF-A和miR-210 mRNA表達高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P<0.01)；PB-MSCs肌組織中VEGF-A mRNA表達高于TXL和Cilostazol(P<0.05)；TXL和PB-MSCs肌組織中miR-210 mRNA表達高于Cilostazol(P<0.01)。見Tab 2。

Tab 2 The mRNA expression of VEGF-A and miR-210 in different groups by Real-time PCR(±s,n=5,RQ value)

**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmodel;##P<0.01vsTXL;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsCilostazol;○○P<0.01vsPB-MSCs

2.3 各組大鼠缺血下肢肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達比較與對照組比較，模型組肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達均明顯升高(P<0.01)。各用藥組組間比較，PB-MSCs肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達均高于Cilostazol(P<0.05)；T-MSCs和C-MSCs肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達均高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P<0.01)。見Fig 1,Tab 3。

Fig 1 The protein expression of VEGF-A and VEGF-R2 of hindlimb ischemia gastrocnemius muscle in different groups

A:Control group; B: Model group; C: TXL group; D: Cilostazol group; E: PB-MSCs group; F: T-MSCs group; G: C-MSCs group

Tab 3 The protein expression of VEGF-A and VEGF-R2 in different groups by Western blot(±s,n=3)

**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmodel;##P<0.01vsTXL;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsCilostazol;○○P<0.01vsPB-MSCs;☆P<0.05vsT-MSCs

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足患者因其長期高血糖，不僅能促進血管病變致嚴重缺血性疾病，而且同時伴有側枝血管形成能力的嚴重損傷[8]。因此其治療關鍵環(huán)節(jié)是怎樣促進缺血狀態(tài)下血管新生及側枝循環(huán)形成，改善缺血血供。目前應用干細胞移植治療糖尿病足，是通過其可促進缺血肢體的新生血管形成，改善和恢復肢體血流，從而達到治療目的[9]。中醫(yī)脈絡學說認為，基于中醫(yī)脈與西醫(yī)血管，脈絡與中小血管、微血管、微循環(huán)在解剖形態(tài)學上的密切相關性，提出“脈絡-血管系統(tǒng)病”概念[10]。糖尿病足是糖尿病日久累及肢體大、中、小、微血管的一類并發(fā)癥，屬于中醫(yī)“消渴脫疽”范疇，可見糖尿病足亦屬于“脈絡-血管系統(tǒng)病”研究的范疇。通心絡是脈絡學說指導下研制的中藥復方制劑，具有益氣活血化瘀、搜風通絡止痛[11]。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)通心絡聯(lián)合自體干細胞移植可以改善干細胞移植環(huán)境，提高糖尿病足臨床療效，且治療效果優(yōu)于單純干細胞移植[12]。因此本實驗探討HIF-1/VEGF通路及miR-210基因表達在通心絡聯(lián)合外周血間充質干細胞移植促進糖尿病足缺血下肢血管新生中的作用機制。

血管新生受多種激酶和生長因子的調節(jié)，而VEGF-A是公認最有效、快速的血管滲透機制誘導因子[13]，其主要通過兩種酪氨酸激酶受體VEGF-R1(fit-1)和VEGF-R2(KDR/flk-1)在ECs上發(fā)揮作用[14]，而VEGF-R2在VEGF所誘導的血管生成中起主要作用[15]。本實驗結果顯示，模型組血清、肌組織中VEGF-A表達明顯降低，與既往臨床研究結果相同[16]，說明VEGF是DF發(fā)生和發(fā)展的重要影響因素，VEGF水平低下可能是導致DF缺血、潰瘍，且經久不愈的重要原因。各用藥組血清、肌組織中VEGF-A表達明顯升高，肌組織中VEGF-R2蛋白表達明顯升高，說明各用藥通過增加肌組織中VEGF-A和VEGF-R2表達，升高血清VEGF-A水平，刺激ECs生長，促進缺血區(qū)血管新生。尤其是通心絡聯(lián)合干細胞組肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達最為明顯，說明通心絡通過上調VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達，而進一步提高干細胞移植治療DF后新生血管形成的數(shù)量。

VEGF的表達受多種因素的調控，缺氧是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強的調節(jié)因子。低氧誘導因子-1(HIF-1)作為一種轉錄因子在低氧條件下通過促VEGF基因轉錄[17]，在調節(jié)組織新生血管的生成中發(fā)揮重要作用。本實驗結果顯示，通心絡聯(lián)合干細胞組血清中HIF-1α水平最高，優(yōu)于通心絡組、西洛他唑組及干細胞組，提示在缺血缺氧條件下，通心絡聯(lián)合干細胞移植通過升高HIF-1α水平表達，促進VEGF基因表達，進而促進血管新生。

微小核糖核酸(miRNA)是一類具有轉錄后調節(jié)活性的高度保守的非編碼小分子RNA，在血管新生的調節(jié)中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-210可直接或間接靶向缺血后血管新生途徑，參與血管新生的調控[18]。在缺氧條件下，miR-210過度表達能促進毛細管狀結構的形成和VEGF介導的ECs遷移[19]。抑制miR-210的表達可減少血管形成和ECs遷移[20]。本實驗結果顯示，模型組肌組織中miR-210基因水平明顯降低，說明持續(xù)的高糖狀態(tài)可能通過抑制miR-210的表達，而減少血管形成和ECs遷移。各用藥組肌組織中miR-210基因水平明顯升高，其中通心絡聯(lián)合干細胞組肌組織中miR-210基因水平優(yōu)于通心絡組、西洛他唑組及干細胞組，提示持續(xù)高糖狀態(tài)下，通心絡聯(lián)合干細胞移植通過上調miR-210基因表達，促進毛細管狀結構的形成和ECs遷移。

因此推測通心絡聯(lián)合外周血間充質干細胞移植治療糖尿病足具有血管新生的作用，其作用機制可能是通過激活HIF-1/VEGF通路及miR-210基因的表達而發(fā)揮作用，且其進一步機制可能是通心絡聯(lián)合外周血間充質干細胞移植治療糖尿病足通過調節(jié)miR-210基因表達，進而激活HIF-1/VEGF通路促進了新生血管形成。

(致謝：本實驗在河北省絡病重點實驗室完成。感謝河北省絡病重點實驗室的各位老師！)

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Treatment effect of Tongxinluo combined peripheral blood derived mesenchymal stem cells transplantation on angiogenesis of HIF-1/VEGF pathway and miR-210 in diabetic foot rats

GUO Yong-ying1, ZHANG Jun-fang2, JIA Cun-qin2, GAO Huai-lin3

(1.HebeiKeyLabforCollateralDisease,Shijiazhuang050035,China;2.HebeiYilingMedicineResearchInstitute,Shijiazhuang050035,China;3.YilingHospitalAffiliatedofHebeiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofCollateralDiseaseTheoryGuidanceinPreventionandTreatmentofDiabeticFootofChineseTraditionalMedicineinHebeiProvince,Shijiazhuang050091,China)

Aim To investigate the treatment effect of Tongxinluo(TXL) combined peripheral blood derived mesenchymal stem cells(PB-MSCs) transplantation on angiogenesis of HIF-1/VEGF pathway and miR-210 in diabetic foot(DF) rats. Methods Seventy male Sprague-Dawley rats were fed with high-fat diet and given combined streptozotocin injection to build diabetic rat model. The femoral artery and vein of right lower extremity of modeled rats were ligatured to induce DF model. The normal rats in the same batch copied ischemia model served as control group. The modeled rats were divided into 6 groups: model group, TXL group, Cilostazol group, PB-MSCs group, TXL combined PB-MSCs(T-MSCs) group and Cilostazol combined PB-MSCs(C-MSCs) group. After the treatment for 28 days, animal gastrocnemius muscle and serum were taken for detection, in which serum was used to detect VEGF-A and HIF-1α by ELISA, and muscle was used to detect VEGF-A and VEGF-R2 by Western blot, and VEGF-A by RT-PCR. Results Compared with the control group, the expressions of VEGF-A, HIF-1α, VEGF-R2 and miR-210 in the model group were significantly reduced(P<0.01).Compared with the model group, the expressions of VEGF-A, VEGF-R2 and miR-210 in each treatment group were significantly increased(P<0.01), where the expressions of VEGF-A, HIF-1α, VEGF-R2 and miR-210 in the T-MSCs were higher than these in the TXL, cilostazol and PB-MSCs group(P<0.05,P<0.01).Conclusion TXL combined with PB-MSCs transplantation may be regulated by HIF-1/VEGF pathway and miR-210, promoting endothelial cell proliferation, differentiation, and promoting the formation of new blood vessels.

peripheral blood derived mesenchymal stem cells；transplant；Tongxinluo；cilostazol；diabetic foot rat model；angiogenesis；HIF-1/VEGF pathway

時間：2015-11-24 11:00 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20151124.1100.048.html

2015-08-14,

2015-10-08

國家高技術研究發(fā)展計劃(863 計劃)項目(No 2011AA020115)；國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(No 2012CB518606)；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(No 2014082)

郭勇英(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：糖尿病及絡病,E-mail:648639404@qq.com； 高懷林(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病及絡病的臨床與科研工作，通訊作者，E-mail:gaohuailin@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.12.024

A

1001-1978(2015)12-1749-06

R-332；R287；R329.24；R364.3；R587.2