劉 智,王健全,王星云,劉 暢,申麗雪,徐慧穎,張大方

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000；3.修正集團(tuán)長(zhǎng)春高新制藥有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130108)

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參附湯抗大鼠心肌缺血作用與apelin表達(dá)的相關(guān)性研究

劉 智1,王健全1,王星云1,劉 暢2,申麗雪3,徐慧穎1,張大方1

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000；3.修正集團(tuán)長(zhǎng)春高新制藥有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130108)

目的 探討參附湯對(duì)異丙腎上腺素(ISO)所致心肌缺血損傷大鼠的作用及apelin蛋白表達(dá)的變化對(duì)心肌缺血的影響。方法 采用皮下注射ISO方法建立心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。灌胃給予大鼠不同劑量的(3、6、12 g·kg-1)參附湯，模型組與空白組灌胃等體積蒸餾水，陽(yáng)性組灌胃參附注射液6.67 g·kg-1，連續(xù)灌胃15 d；從d 11開始，灌胃1 h后，皮下多點(diǎn)注射ISO，連續(xù)5 d造模。造模后考察參附湯對(duì)心肌組織形態(tài)學(xué)、血清中心肌酶含量、心肌組織中apelin mRNA含量及血清中apelin蛋白含量的影響，并探討心肌酶與apelin表達(dá)變化的相關(guān)性。結(jié)果 參附湯可以明顯減輕心肌組織壞死程度；與模型組相比，參附湯中、高劑量組肌酸激酶(CK)值及各劑量組的乳酸脫氫酶(LDH)值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；參附湯中、高劑量組大鼠血清apelin蛋白含量及心肌組織mRNA含量與模型組相比，均明顯升高(P<0.05，P<0.01)；此外，血清apelin與心肌酶CK、LDH的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 參附湯具有抗ISO所致大鼠心肌缺血作用，該作用機(jī)制與其促進(jìn)apelin mRNA表達(dá)，使apelin蛋白含量增多，從而抑制心肌酶生成，改善心肌缺血有關(guān)。

參附湯；異丙腎上腺素；心肌缺血；肌酸激酶；乳酸脫氫酶；apelin

Apelin是一種心血管活性多肽，是由日本學(xué)者1998年利用反向藥理學(xué)的方法從牛胃的分泌物中提取并純化出的反義G蛋白偶聯(lián)受體-血管緊張素受體AT1相關(guān)蛋白的天然配體[1]，其對(duì)多種因素所致的心臟損傷均有保護(hù)作用[2]。參附湯(shenfu soup,SF)是由人參、附子組成的經(jīng)典名方，附子、人參相使配伍，可達(dá)到減毒增效的作用[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，SF具有增加冠脈流量，提高超氧化物歧化酶活性，改善血流動(dòng)力學(xué)，抵抗心肌受損等功效[4-7]。本文擬通過(guò)皮下多點(diǎn)注射ISO方法建立大鼠心肌缺血模型，測(cè)定心肌酶等含量變化及apelin表達(dá)情況，并通過(guò)相關(guān)性分析探討SF抗心肌缺血時(shí)心肌酶與apelin表達(dá)變化的相關(guān)性，從而揭示SF抗大鼠心肌缺血損傷作用的相關(guān)機(jī)制，為臨床用藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂ SD大鼠(180～200 g)，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK-(吉)2012-0003。

1.1.2 藥品與試劑 ISO：上?？畦b生物科技有限公司，批號(hào)：100166-201204；CK、LDH檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；apelin檢測(cè)試劑盒：REF DRE21040 201304；Simply P總RNA提取試劑盒：杭州博日科技有限公司；Bio RT逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒：杭州博日科技有限公司；SYBR GREEN PCR Master Mix試劑盒：杭州博日科技有限公司；參附注射液：雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)120505；附子、人參購(gòu)自于長(zhǎng)春宏檢藥業(yè)，按附子 ∶人參(2 ∶1)的比例稱取藥材，常規(guī)煎煮濃縮并凍干備用。

1.1.3 儀器 BL-420生物信號(hào)采集系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司；新世紀(jì)T6紫外分光光度計(jì)：北京普析科技有限公司；Model 680酶標(biāo)儀：美國(guó)伯樂(lè)；低溫高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Bio Spec-nano：日本島津公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 篩選動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)分組 將麻醉大鼠仰臥位固定于鼠板上，將針狀電極插入四肢及胸前心尖搏動(dòng)處皮下。記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或Ⅱ?qū)?lián)心電圖，觀察是否正常，棄去ST段有異常變化者和心律失常者。取符合條件的大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組各10只，分別為空白對(duì)照組(Sham)，模型組(Model)，參附注射液組(SF injection)，參附湯低、中、高劑量組，普食喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2.2 造模及給藥方法 空白對(duì)照組：灌胃蒸餾水；模型組：灌胃蒸餾水，并于實(shí)驗(yàn)d 11，灌胃后30 min立即腹腔注射2 mg·kg-1ISO，30 min后將大鼠放入冰水中游泳5 min；參附注射液口服組：6.67 mg·kg-1參附注射液灌胃，其他同模型組；參附湯低、中、高劑量組：3、6、12 g·kg-1參附湯灌胃，其他同模型組。各組大鼠于給藥d 15后腹腔注射20%烏拉坦 5 mL·kg-1麻醉，采用BL-420生物信號(hào)采集系統(tǒng)測(cè)量各組大鼠的ST段心電。腹主動(dòng)脈取血，3 000 r·min-1離心15 min，取上清，凍存?zhèn)溆?；一部分心臟迅速放入液氮中凍存，一部分心臟放入福爾馬林固定液中固定。

1.2.3 HE染色檢測(cè)大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變情況 腹腔注射20%烏拉坦5 mL·kg-1麻醉大鼠，取心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，放入10%福爾馬林中固定24 h，石蠟包埋標(biāo)本，切片，行HE染色，Leica光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)情況。

1.2.4 血清相關(guān)蛋白含量檢測(cè) 末次給ISO后24 h，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，3 000 r·min-1離心15 min，取上清，按照試劑盒說(shuō)明書中操作方法檢測(cè)血清CK、LDH及apelin含量。

1.2.5 Real-time RT-PCR檢測(cè)心肌組織中apelin mRNA的表達(dá) 取冷凍心肌組織標(biāo)本，按照Simply P總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA；吸取1 μL總RNA用Bio Spec-nano檢測(cè)濃度；按照兩步法Bio RT逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；參照Bio Easy SYBR Green I Real Time PCR Kit Manual說(shuō)明書，采用三步法程序進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，94℃預(yù)變性2 min，94℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。在30℃～95℃區(qū)間內(nèi)進(jìn)行融解試驗(yàn)，并繪制融解度曲線，目標(biāo)基因表達(dá)相對(duì)定量分析2-ΔΔCt法。

Tab 1 Primer pairs used in Real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)期間空白組大鼠活潑好動(dòng)，毛發(fā)整齊有光澤，呈白色，不易脫落，抓取時(shí)主動(dòng)逃避，反抗較??；而模型組大鼠造模后活動(dòng)較少，嗜睡，精神萎靡，毛色枯槁，多倒豎，易脫落，抓取時(shí)反抗較輕。

2.2 參附湯對(duì)大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響與空白組比較，各組大鼠心臟心內(nèi)膜不同程度的呈彌漫性心肌組織壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),纖維組織增生，以模型組最為嚴(yán)重，而各給藥組壞死程度明顯減小。見Fig 1。

2.2 參附湯對(duì)大鼠血清相關(guān)蛋白含量的影響與空白組相比，模型組大鼠CK、LDH值明顯升高(P<0.01)，而apelin含量明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，參附注射液組、參附湯低、中、高劑量組CK值均有一定程度的降低，除參附湯低劑量組外，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，各給藥組LDH值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；而參附注射液組、參附湯中、高劑量組中apelin含量與模型組相比，均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見Tab 2。

Fig 1 Effects of Shenfu Soup administration on morphological changes in myocardial ischemia of rats A:Sham; B:Model; C:SF injection; D:SF 3 g·kg-1; E:SF 6 g·kg-1; F:SF 12 g·kg-1

GroupDosage/g·kg-1CK/U·L-1LDH/U·L-1apelin/ng·L-1Sham-73．15±4．30539．78±75．68887．12±104．31Model-94．75±3．78△△961．15±68．34△△341．17±35．21△△SFinjection6．6778．76±7．23??687．22±90．86?628．04±99．74??SF389．11±3．8823．08±58．24??459．12±83．56683．91±6．85?700．70±119．62??527．05±112．75?1281．43±3．72??727．52±72．47??615．46±109．12??

△△P<0.01vsSham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.3 給予參附湯后模型大鼠心肌酶與apelin含量變化的相關(guān)性分析血漿apelin與心肌酶CK、LDH的相關(guān)分析顯示，apelin與CK、LDH呈負(fù)相關(guān)(r=-0.819和r=-0.794,P=0.000)，存在相關(guān)性。

2.4 參附湯對(duì)心肌缺血大鼠心肌組織中apelin mRNA表達(dá)的影響Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織apelin mRNA明顯下降(P<0.01)。參附注射液組和參附湯中、高劑量組均可以明顯上調(diào)由ISO素所致的apelin mRNA下降(P<0.01)；參附湯低劑量組也有上調(diào)的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Effects of Shenfu soup on mRNA of apelin in cardiac tissue of myocardial ischemia rats (±s, n=3)

△△P<0.01vssham;**P<0.01vsmodel.

3 討論

Apelin在體內(nèi)分布廣泛，中樞與外周組織均有不同水平的表達(dá)，尤其在不同組織血管的內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，與心血管的發(fā)育和功能有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組血漿apelin含量明顯降低；同時(shí)，與模型組相比，各給藥組大鼠血漿中apelin含量均有所升高，其中參附注射液組、參附湯中、高劑量組中apelin含量與模型組相比，明顯升高。以上結(jié)果提示參附湯可能通過(guò)影響apelin水平改善缺血心肌血管舒縮功能，從而發(fā)揮抗心肌缺血損傷作用。

CK、LDH等酶廣泛存在在心肌組織細(xì)胞中，在維持心肌正常生理功能方面發(fā)揮著重要的生理作用[9]，血清中CK、LDH值在正常情況下要比組織中低1000倍左右[10]。研究表明，心肌缺血后代謝紊亂，心肌組織嚴(yán)重?fù)p傷，各種酶被釋放出來(lái)，其中血清CK、LDH 含量明顯增加，其升高程度與心肌梗死程度相平行且有加重缺血對(duì)心肌的損傷作用[10-13]。在本研究中，模型組大鼠血清中 CK、LDH 含量明顯升高，說(shuō)明心肌細(xì)胞受損；此外，各給藥組可明顯降低急性心肌缺血大鼠血清中CK、LDH含量，表明參附湯能夠加強(qiáng)對(duì)心肌缺血時(shí)氧自由基的清除能力，增強(qiáng)心肌細(xì)胞有氧代謝，減輕心肌細(xì)胞變性及心肌組織的損害。同時(shí)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血漿apelin含量與心肌酶CK、LDH含量存在相關(guān)性。由此推測(cè)，參附湯抗心肌缺血損傷的機(jī)制可能與其明顯增加apelin表達(dá)，進(jìn)而降低心肌酶CK、LDH表達(dá)作用密切相關(guān)。

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Protective effect of Shenfu soup on myocardial ischemia in rats and expression of apelin

LIU Zhi1,WANG Jian-quan1, WANG Xing-yun1, LIU Chang2, SHEN Li-xue3, XU Hui-ying1, ZHANG Da-fang1

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun,130117，China; 2.ChangchunDiruiMedicalTechnologyCo.,Changchun130000,China; 3.ChangchunGaoxinPharmaceuticalCo.ofXiuzhengPharmaceuticalGroup,Changchun130108,China)

Aim To study the effects of Shenfu soup on the ISO-induced myocardial ischemia injury model of rats and the influence of apelin level changes on myocardial ischemia. Methods The myocardial ischemia injury model of rats was established by the subcutaneous injection of ISO. For 15 days, rats in Shenfu groups were given by gavage 3, 6 and 12 g·kg-1Shenfu soup and rats in SF injection group were given 6.67 g·kg-1Shenfu injection, rats in sham group and model group were given the same volume of distilled water. Rats were subcutaneously multi-point injected ISO for 5 days on the eleventh administrating day. The effects of Shenfu soup on myocardial morphology, serum myocardial enzyme levels, apelin mRNA level in serum and apelin protein level in myocardial tissue, and relationship between myocardial enzyme and apelin expression were evaluated. Results Shenfu soup could reduce the degree of myocardial tissue necrosis and compared with model group, CK values and LDH values of rats in middle-and high-dose groups were significantly lower (P<0.05 orP<0.01). However, the apelin mRNA level in myocardial tissue and apelin protein level in serum of the rats in middle- and high-dose groups compared with model group had increased (P<0.05,P<0.01). Meanwhile, serum levels of apelin and the expression of myocardial enzyme CK and LDH were negatively correlated. Conclusion Shenfu soup has a protective effect on myocardial ischemia injury in rats induced by ISO and the mechanism is involved with the promotion of apelin mRNA and protein expression, the inhibition of myocardial enzyme production and the improvement of myocardial ischemia.

Shenfu soup; ISO; myocardial ischemia; CK; LDH; apelin

時(shí)間：2015-11-24 11:00 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20151124.1100.052.html

2015-08-11,

2015-09-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81173597/H2809)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金新教師類(No 20122227120003)，國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No 201410199005)；吉林省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目(No 2014-Q21)

劉 智(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：中藥復(fù)方藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制,E-mail：54876760@qq.com; 王星云(1964-)，女，講師，研究方向：醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)與流行病學(xué)，通訊作者，E-mail：970975718@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.12.026

A

1001-1978(2015)12-1760-04

R-332；R289.5；R322.11；R542.202.2；R977.3；R977.6