趙鐵華，史子惠，張另沾

(1.河北師范大學(xué)藥物研究所，河北 石家莊 050024；2.安徽華星化工股份有限公司，安徽 合肥 230088)

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125I標(biāo)記聚乙二醇化EILDVP肽的小鼠體內(nèi)血藥濃度

趙鐵華1，史子惠2，張另沾1

(1.河北師范大學(xué)藥物研究所，河北 石家莊 050024；2.安徽華星化工股份有限公司，安徽 合肥 230088)

目的 探討聚乙二醇修飾改善EILDVP肽體內(nèi)過程的效果。方法 KM小鼠以NaI飽和甲狀腺后，按5 mL·kg-1容積，分別尾靜脈注射3.441GBq·L-1濃度的125I標(biāo)記的EILDVP-Tyr-NH2、EILDVP-Cys (mPEG2000-MAL)-Tyr-NH2和EILDVP-Cys (mPEG20000-MAL)-Tyr-NH2肽。給藥后不同時間取血，分離血漿，經(jīng)三氯乙酸處理后測定沉淀部分放射性；測定數(shù)據(jù)分別代入已制備的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，取得血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，經(jīng)3P97藥動學(xué)統(tǒng)計軟件計算主要藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 在3.75 ～480 μg·L-1濃度范圍內(nèi)，3種125I標(biāo)記肽線性關(guān)系良好，回收率在88.92%～106.66%之間，日內(nèi)變異系數(shù)(RSD)<10%；125I標(biāo)記的mPEG2000和mPEG20000修飾EILDVP-Tyr-NH2肽的血漿半衰期(T1/2)分別為0.43 h和1.94 h、較原型肽(0.28 h)延長1.54倍和6.93倍，清除率(Cl)分別降低1.23倍和24.71倍；3種受試化合物表觀分布容積(V)值均較小，主要分布在血漿中。結(jié)論 適宜分子質(zhì)量mPEG修飾有利于延長EILDVP肽的體內(nèi)維持時間，對提高藥效具有積極意義；在實驗范圍內(nèi)，分子質(zhì)量較大的mPEG20000對EILDVP肽修飾效果較好。

VLA-4拮抗藥；EILDVP肽；聚乙二醇修飾；藥代動力學(xué)；血藥濃度；小鼠

EILDVP(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro)是細(xì)胞外基質(zhì)纖維黏連蛋白(NF)與極遲抗原-4(very late antigen-4，VLA-4；整合蛋白α4β1)結(jié)合的配體的CS-1區(qū)序列，其中LDV(Leu-Asp-Val)序列為其關(guān)鍵的三肽[1]。VLA-4廣泛分布于淋巴細(xì)胞、中性和嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表面，其與NF、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)的結(jié)合和相互作用是炎癥啟動和發(fā)展過程中炎性細(xì)胞黏附、遷移至血管外組織的關(guān)鍵步驟。研究表明，EILDVP等含LDV序列肽可競爭抑制炎細(xì)胞與NF、VCAM-1的結(jié)合和相互作用，干擾類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘等慢性炎癥和自身免疫性疾病的病理過程[2-6]。但是，與其它肽類分子性質(zhì)相似，現(xiàn)有以LDV序列為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的VLA-4拮抗肽由于分子量小，易被清除和酶解破壞，其體內(nèi)代謝時間短，較大的治療劑量和較短的給藥時間間隔可能成為其應(yīng)用的障礙。利用目前國際公認(rèn)的聚乙二醇(polyethlene glycol，PEG)修飾增加蛋白質(zhì)和多肽藥物穩(wěn)定性、延長血漿半衰期等藥物性能改善特點，我們對EILDVP肽進(jìn)行了聚乙二醇修飾[5-7]。本文比較了125I標(biāo)記2 ku和20 ku分子質(zhì)量直鏈甲氧基聚乙二醇(mPEG2000和mPEG20000)修飾EILDVP肽的小鼠血藥濃度和相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)，實驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 受試化合物與試劑化合物A：EILDVP-Tyr-NH2、化合物B(mPEG2000修飾肽)：EILDVP-Cys(mPEG2000-MAL)-Tyr-NH2、化合物C(mPEG20000修飾肽)：EILDVP-Cys (mPEG20000-MAL)-Tyr-NH2，為本實驗室采用Fmoc固相方法合成，RP-HPLC方法純化，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.995、0.959和0.992；MS鑒定，化合物A分子質(zhì)量為847.6 u，化合物B在3 050.0 u附近有一組相差44的峰，化合物C在21 050.7 u附近有一組相差44的峰，與預(yù)期相符。委托北方生物技術(shù)研究所采用氯胺T法對3種化合物進(jìn)行125I標(biāo)記，并經(jīng)PR-HPLC方法分離純化；標(biāo)記化合物A放射性比活性為1.005 Bq·g-1、化合物B為0.344 Bq·g-1、化合物C為0.264 Bq·g-1；3種125I標(biāo)記肽放化純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 均高于0.95；生理鹽水稀釋至使用濃度。碘化鈉(NaI)、三氯乙酸(TCA)為天津大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，分析純；其余試劑為國產(chǎn)分析純；實驗用水為超純水。

1.2 主要儀器γ 計數(shù)器：MF-1000型，西安凱普公司產(chǎn)品；低溫冷凍離心機：KDC-2046型，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物及其分組給藥KM小鼠，清潔級，體質(zhì)量20～25 g，由河北省實驗動物中心提供，合格證編號810145。以上小鼠隨機分為125I標(biāo)記的化合物A、B、C 3組。實驗前12 h，各小鼠im質(zhì)量濃度20 g·L-1NaI生理鹽水溶液0.25 mL飽和甲狀腺，禁食不禁水，參考預(yù)實驗計算的3種125I標(biāo)記肽半衰期(T1/2)和初始血藥濃度(C0)，進(jìn)一步按給藥后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24、32、48和72 h采血時間點，將小鼠隨機分為A組0.08～6 h組、B組0.08～32 h組、C組0.08～72 h組，每組5只小鼠，♀♂兼用(♀3只♂2只，或♀2只♂3只)，按5 mL·kg-1容積分別尾靜脈注射3.441GBq·L-1濃度的3種125I標(biāo)記肽。

1.4 血樣樣品處理[8]各組單次給藥后, 分別在各采血時間點, 于動物眼眶取血0.2 mL，肝素抗凝, 全血在4℃條件下6 000×g離心10 min，取血漿-20℃保存?zhèn)溆?。檢測時取25 μL血漿樣品, 加入175 μL純水, 混勻后，加入等容積質(zhì)量濃度200 g·L-1的TCA溶液沉淀蛋白, 4℃條件下6 000×g離心10 min后棄上清, 測定酸沉淀部分的放射性，換算為μmol·L-1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備[8]分別將3種125I標(biāo)記肽以純水配制成3.75、7.5、15、30、60、120、240、480 μg·L-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取以上標(biāo)準(zhǔn)液10 μL，加入小鼠空白血漿25 μL、純水165 μL，混勻后加入等容積質(zhì)量濃度200 g·L-1的TCA溶液沉淀蛋白，每個濃度做3個平行管，“1.4”方法測定沉淀部分放射性，換算為μmol·L-1。以測定樣品125I標(biāo)記肽濃度為橫坐標(biāo)，放射性為縱坐標(biāo)，分別做3種125I標(biāo)記肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 樣品在血漿中回收率、精密度測定[8]按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中溶液的配制方法，將3種125I標(biāo)記肽分別配制為15、60、240 μg·L-1濃度, 分別進(jìn)行回收率和精密度測定?；厥章实臏y定：取3個濃度3種125I標(biāo)記肽稀釋液，測定其總放射性, 用等容積質(zhì)量濃度200 g·L-1的TCA沉淀后，測定其沉淀放射性，計算沉淀放射性占總放射性的百分比。精密度的測定：3種125I標(biāo)記肽每個濃度設(shè)6個平行管，同批測定, 評價批內(nèi)精密度。

1.7 實驗動物血藥濃度的測定和藥代動力學(xué)參數(shù)計算各組小鼠按“1.3”方法尾靜脈注射3種125I標(biāo)記肽，按“1.4”方法取樣并測定沉淀物放射性，測定并換算數(shù)據(jù)分別代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出各時間點血藥濃度。3P97藥動學(xué)統(tǒng)計軟件對取得的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計算藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

Tab 1 Recovery rate and precision of EILDVP peptide labeled by 125I and modified by polyethylene glycol of test results (±s,n=6)

EILDVP-Tyr-NH2，EILDVP-Cys(mPEG2000-MAL)-Tyr-NH2and EILDVP-Cys(mPEG20000-MAL)-Tyr-NH2peptide labeled by125I are separately A，B，C.

2.2 125I標(biāo)記EILDVP及其聚乙二醇修飾肽的小鼠體內(nèi)血藥濃度和藥代動力學(xué)參數(shù)小鼠尾靜脈注射3.441 GBq·L-1濃度(5 mL·kg-1容積)3種125I標(biāo)記肽后，不同時間點血漿經(jīng)TCA沉淀后測定放射性，測定并換算數(shù)據(jù)分別代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，取得血藥濃度-時間數(shù)據(jù)(Fig 1)，經(jīng)3P97藥動學(xué)統(tǒng)計軟件分析房室數(shù)為1，計算主要藥代動力學(xué)參數(shù)(Tab 2)；其中mPEG20000修飾肽的血漿半衰期(T1/2)明顯高于原型肽(化合物A)、清除率(Cl)明顯低于原型肽；125I標(biāo)記EILDVP-Cys (mPEG20000-MAL)-Tyr-NH2(化合物C)組小鼠血漿，在0.08 h時因125I劑量致放射性測量值溢出儀器的讀出范圍，未影響3P97軟件對本組藥代動力學(xué)參數(shù)的計算。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of EILDVP peptide labeled by 125I and modified by polyethylene glycol after i.v. injection in rats(±s,n=5)

EILDVP-Tyr-NH2,EILDVP-Cys(mPEG2000-MAL)-Tyr-NH2and EILDVP-Cys(mPEG20000-MAL)-Tyr-NH2peptide labeled by125I are separately A,B,C.

Fig 1 Blood drug concentration-time curve of EILDVP peptide labeled by 125I and modified by polyethylene glycol

EILDVP-Tyr-NH2,EILDVP-Cys(mPEG2000-MAL)-Tyr-NH2and EILDVP-Cys(mPEG20000-MAL)-Tyr-NH2peptide labeled by125I are separately A,B,C.

3 討論

3.1 被修飾肽的設(shè)計相關(guān)研究資料和我們既往實驗結(jié)果提示，EILDVP(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro)等含LDV(Leu-Asp-Val)關(guān)鍵序列的VLA-4拮抗肽具有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性哮喘等免疫性炎癥的潛在藥用價值，并且聚乙二醇修飾可通過增加體內(nèi)穩(wěn)定性、延長半衰期等機制增強肽類分子藥理活性[2-7]。本實驗在EILDVP-Cys(mPEG2000-MAL)-Tyr-NH2等肽結(jié)構(gòu)中設(shè)計加入Tyr，是為EILDVP肽提供原結(jié)構(gòu)中缺乏的125I標(biāo)記部位[9]；利用某些mPEG衍生物特異修飾Cys的特性，在短肽C端加入Cys以提供mPEG定點巰基修飾部位，預(yù)期防止隨機修飾可能發(fā)生的修飾物對短肽生物活性部位的屏蔽[10]。

3.2 修飾物mPEG的分子質(zhì)量本實驗以預(yù)期提高被修飾物體內(nèi)穩(wěn)定性、半衰期，并較大程度保留原型化合物活性為目的，依據(jù)被修飾蛋白質(zhì)或肽類分子在體內(nèi)的作用時間與偶聯(lián)的PEG數(shù)量和相對分子質(zhì)量成正比、生物活性與PEG相對分子質(zhì)量成反比的蛋白質(zhì)和肽類藥物化學(xué)修飾的基本規(guī)律[11]，參考既往2 ku分子質(zhì)量 mPEG延長約0.5 ku分子質(zhì)量短肽半衰期2倍以上的實驗結(jié)果[7]，選擇分子質(zhì)量分別為2 ku和20 ku的直鏈甲氧基聚乙二醇(mPEG2000和mPEG20000)為修飾物，主要觀察和比較mPEG20000對短肽的修飾效果。

3.3 結(jié)果分析本實驗藥代動力學(xué)參數(shù)顯示，125I標(biāo)記的mPEG2000和mPEG20000修飾肽較原型EILDVP-Tyr-NH2肽的血漿半衰期(T1/2)分別延長1.54倍和6.93倍，清除率(Cl)分別降低1.23倍和24.71倍；3種受試化合物表觀分布容積(V)均較小，數(shù)據(jù)提示主要分布在血漿，原因是否與其血漿蛋白結(jié)合率有關(guān)，尚待直接測試驗證；受單一給藥途徑限制，因125I 標(biāo)記量及儀器測量范圍所致3種受試化合物動物單位體質(zhì)量給藥劑量差異，不能分析本文mPEG20000修飾肽曲線下面積(AUC)數(shù)值與另2種受試化合物的差異。

本實驗單劑量3種受試化合物的小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)分析結(jié)果提示，適宜分子質(zhì)量的直鏈甲氧基聚乙二醇(mPEG)修飾有利于延長EILDVP肽在體內(nèi)的維持時間，從而保證有效濃度藥物分子產(chǎn)生活性，對提高藥效具有積極意義；在實驗涉及分子質(zhì)量范圍內(nèi)，分子質(zhì)量較大(20 ku)的mPEG對EILDVP肽修飾效果較好。以上結(jié)果與我們既往mPEG修飾含LDV序列肽抗炎作用增強的藥效實驗結(jié)果吻合[6]。

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Plasma concentration of125I labeled and polyethylene glycol conjugation to EILDVP peptide in mice

ZHAO Tie-hua1，SHI Zi-hui2，ZHANG Ling-zhan1

(1．InstituteofMateriaMedica,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050024,China；2．AnhuiHuaxingChemicalIndustryCo.LTd，Hefei230088,China)

Aim To study the pharmacokinetics of polyethylene glycol conjugation on EILDVP peptide in mice by injection through tail vein. Methods KM mice, saturated thyroid gland with compound of NaI,were injected for125I labeled EILDVP-Tyr-NH2, EILDVP-Cys (mPEG2000-MAL)-Tyr-NH2and EILDVP-Cys(mPEG20000-MAL)-Tyr-NH2peptides (125I: 5 mL·kg-1volume 3.441 GBq·L-1concentration) by tail intravenous, respectively. Blood samples at different time intervals were obtained,blood plasma was separated,and the radioactivity of precipitation after trichloroacetic acid (TCA) treatment was tested. According to standard curve equation, the plasma concentration curve and pharmocokinetic parameters were depicted by means of 3P97 pharmocokinetics software. Results Concentration range of 3.75～480 μg·L-1of three125I labled peptides in plasma from mice had good linear relationship. Recovery of method was 88.92%～106.66%, and RSD<10%. The half-life time (T1/2) of EILDVP-Tyr-NH2peptide modified by mPEG2000and mPEG20000, labled by125I was 0.43h and 1.94h,respectively, which was 1.54 times and 6.93 times that of prototype peptide (T1/2=0.28h), and the clearances (Cl) were 1.23 times and 24.71 times,respectively. The apparent distribution volume (V) values of the three species were small, which might mainly distributed in the plasma. Conclusions Suitable for molecular mass mPEG modified the EILDVP peptides could extend to maintain timeinvivo, which could play a positive role in improving efficacy. In the experimental range, EILDVP peptide modified by larger molecular mass of mPEG20000has better effect.

VLA-4 antagonist medicine; EILDVP peptide; PEG; pharmacokinetics; plasma cencentration; mice

時間：2015-11-24 11:00 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20151124.1100.046.html

2015-08-05,

2015-09-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 30672561)

趙鐵華(1957-)，男，碩士，教授，研究方向：中藥、天然藥物有效成分和多肽設(shè)計合成，通訊作者，Tel：0311-80787425，E-mail：zhaotiehua@163.com; 史子惠(1983-)，女，碩士，工程師，研究方向：多肽藥物，通訊作者，E-mail：shizihui1983@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.12.023

A

1001-1978(2015)12-1745-04

R-332；R446.11；R969.1；R977.6