李秀娟， 李玉珍， 金春亭， 范 婕， 李海軍

(河北北方學(xué)院病理教研室， 河北 張家口 075000)

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姜黃素作用PTEN/PI3K/AKT通路誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞凋亡*

李秀娟△， 李玉珍， 金春亭， 范 婕， 李海軍

(河北北方學(xué)院病理教研室， 河北 張家口 075000)

目的：研究姜黃素作用食管癌的分子機制。方法：體外培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞(EC109)，15～120 μmol/L姜黃素處理后，采用CCK-8法檢測姜黃素對細(xì)胞的增殖抑制作用，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，Annexin V-FITC/PI雙染激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)分析15～120 μmol/L姜黃素作用EC109細(xì)胞后PTEN/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白PTEN、AKT、GSK3β和Caspase 3的表達(dá)水平。結(jié)果：CCK-8檢測結(jié)果姜黃素能顯著抑制EC109細(xì)胞的增殖，呈劑量和時間效應(yīng)關(guān)系；透射電鏡和激光共聚集顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)姜黃素能使EC109細(xì)胞發(fā)生凋亡；流式細(xì)胞儀蛋白水平分析顯示姜黃素可增強細(xì)胞中PTEN、GSK3β和Caspase 3的表達(dá)，抑制AKT的表達(dá)。結(jié)論：姜黃素抑制EC109細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡的生物學(xué)效應(yīng)與增強PTEN的表達(dá)抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

姜黃素；PTEN/PI3K/AKT通路；食管癌

姜黃素是從姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種植物多酚，由于其抗炎、抗氧化、降血脂、抗動脈硬化及抗腫瘤等廣泛的藥理作用日益受到研究者的重視[1]。有資料顯示[2-3]姜黃素抗腫瘤的作用通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實現(xiàn)，但其發(fā)揮生物學(xué)作用的精確靶點目前還不十分清楚。腫瘤發(fā)生過程中抑癌基因PTEN 的突變使其喪失了調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路的能力，細(xì)胞增殖失去控制，從而引起癌變。目前在建立的小鼠模型中已經(jīng)觀察到該通路異常所導(dǎo)致的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生[4]，但姜黃素誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞凋亡的過程中是否有該通路的參與還不明確。本研究旨在探討PTEN/PI3K/AKT通路在姜黃素誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞凋亡中的作用，進(jìn)一步明確姜黃素誘導(dǎo)EC109細(xì)胞凋亡的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

姜黃素購自美國Sigma公司，溶解于二甲基亞楓(DMSO)中配成濃度為10 mmol/L的母液，-20℃避光保存。 CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。鼠抗人單克隆抗體PTEN、鼠抗人單克隆抗體AKT、兔抗人單克隆抗體GSK3β、鼠抗人單克隆抗體Caspase 3及羊抗鼠、羊抗兔FITC-IgG抗體均為Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc公司產(chǎn)品。

人食管癌EC109細(xì)胞株由河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心細(xì)胞室提供，細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2及濕度飽和的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基每24小時更換一次，待細(xì)胞生長融合率達(dá)到80%時0.25%胰酶消化、傳代，選用狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的三代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2 細(xì)胞增殖抑制實驗

EC109細(xì)胞胰酶消化收集，顯微鏡下計數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104cells/ml，以每孔200 μl細(xì)胞懸液的量接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中24 h待其貼壁后，分別加入濃度為15、30、60、120 μmol/L姜黃素，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔終體積為200 μl，對照組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。達(dá)到相應(yīng)培養(yǎng)時間后，每孔加入CCK-8溶液10 μl，溫育1 h用酶標(biāo)儀測定各孔570 nm波長處吸光度(OD值)，計算細(xì)胞抑制率(%)=(1-OD處理組/OD對照組)和半數(shù)抑制濃度(IC50)，每組實驗重復(fù)3次。

1.3 透射電鏡細(xì)胞樣品制備

制備濃度為1×105cells/ml細(xì)胞懸液，接種于一批50 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱中過夜后棄去各瓶中的培養(yǎng)基，處理組加入15～120 μmol/L姜黃素1.5 ml和1.5 ml培養(yǎng)基使終體積為3 ml，對照組加入等量培養(yǎng)基，24 h胰酶消化收集各瓶細(xì)胞及上清于離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗3次，2.5%戊二醛4℃固定，PBS沖洗，置于1%鋨酸1.5 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋，聚合72 h修塊、切片、醋酸雙氧鈾和檸檬鉛雙染。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染激光共聚焦顯微鏡觀察

將濃度為5×104cells/ml的EC109細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后棄上清加入15～120 μmol/L姜黃素，對照組加等量培養(yǎng)基，24 h后棄上清，PBS清洗，依次分別加入500 μl Buffer緩沖液、5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光放置，5～15 min后激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測蛋白水平

將濃度為5×104cells/ml細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱中過夜后棄去各瓶中的培養(yǎng)基，處理組分別加入15～120 μmol/L姜黃素1.5 ml和1.5 ml培養(yǎng)基，對照組加入等量培養(yǎng)基，24 h后消化收集各瓶細(xì)胞及上清于離心管中，1 500 r/min離心7 min，棄上清，PBS清洗2次棄上清，每份樣品加入一抗工作液100 μl，37℃水浴30 min，PBS清洗2次棄上清加入二抗工作液100 μl，37℃水浴30 min，PBS清洗2次棄上清，加入1 mlPBS經(jīng)400目篩網(wǎng)過濾后上機檢測。并設(shè)PBS代替一抗和二抗的陰性對照，只加二抗的陰性對照及用同型抗體替代抗體作同型對照。

應(yīng)用Expo3.2ADC對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以熒光指數(shù)(FI)表示各蛋白的相對含量，F(xiàn)I=(樣品基因蛋白表達(dá)的熒光強度-正常樣品的熒光強度)/正常樣品的熒光強度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對EC109細(xì)胞增殖的抑制作用

15～120 μmol/L姜黃素處理EC109細(xì)胞后，細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，呈明顯的劑量和時間效應(yīng)關(guān)系，且與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。姜黃素作用24和48 h，EC109細(xì)胞株的IC50分別為(63.46±1.82)、(45.37±1.24)，即隨著處理時間的延長，IC50逐漸減小(P<0.05, 圖1)。

2.2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

對照組EC109細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞膜完整，可見雙層核膜結(jié)構(gòu)，核仁大而圓。15、30 μmol/L姜黃素作用24 h，細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小，核仁減少等凋亡特征，60、120 μmol/L姜黃素處理后，細(xì)胞核仁消失，染色質(zhì)核膜下聚集成半月形，胞漿空泡化，核膜破裂，凋亡特征明顯(圖2)。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡

對照組活細(xì)胞不著色，熒光為陰性。15、30 μmol/L姜黃素處理后，Ec-109細(xì)胞呈綠色熒光，說明此時細(xì)胞僅和Annexin V結(jié)合，即處于凋亡早期。60、120 μmol/L姜黃素作用后，細(xì)胞主要與PI結(jié)合呈紅色熒光，此時細(xì)胞處于凋亡中晚期(圖3)。

Fig. 2 The ultrastructure of curcumin-treated EC109 cells A： Control； B： 15 μmol/L curcumin； C： 30 μmol/L curcumin； D： 60 μmol/L curcumin； E： 120 μmol/L curcumin

Fig. 3 The cell apoptosis by AnnexinV-FITC/PI double staining A： Control； B： 15 μmol/L curcumin； C： 30 μmol/L curcumin； D： 60 μmol/L curcumin； E： 120 μmol/L curcumin

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測姜黃素對EC109細(xì)胞PTEN/PI3K/AKT通路上相關(guān)蛋白PTEN、AKT、 GSK3β和Caspase 3表達(dá)的影響。15～120 μmol/L姜黃素作用EC109細(xì)胞24 h后，PTEN、GSK3β和Caspase 3蛋白表達(dá)逐漸增多，而AKT表達(dá)逐漸減少。與對照組比較，30、60、120 μmol/L姜黃素作用后PTEN蛋白表達(dá)增多顯著，60、120 μmol/L姜黃素處理后AKT表達(dá)下降，GSK3β表達(dá)明顯升高，15～120 μmol/L姜黃素處理EC109細(xì)胞后Caspase 3表達(dá)也顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖4)。

GroupFIPTEN AKT GSK3β Caspase3 01.23±0.121.64±0.081.58±0.071.78±0.12151.36±0.071.56±0.051.76±0.021.98±0.05**301.46±0.03**1.52±0.081.91±0.062.32±0.12**601.57±0.05**1.43±0.06*2.01±0.09**2.53±0.11**1201.83±0.09**1.34±0.06**2.05±0.09**2.76±0.06**

FI: Fluorescence index

*P<0.05，**P<0.01vscontrol(0 μmol/L curcumin)

Fig. 4 The protein level of PTEN,AKT,GSK3β and Caspase 3 by FCM a、c、e、g： The fluorescence expression intensity of PTEN，AKT，GSK3β and Caspase 3 of control； b、d、f、h： The fluorescence expression intensity of PTEN，AKT，GSK3β and Caspase 3 by 120 μmol/L curcumin

3 討論

姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金、羲術(shù)等活血化瘀藥物中出提取出的中藥單體,以姜黃含量最大[5]，其藥理作用十分廣泛，主要特性為抗炎、抗氧化和抗腫瘤，在抗腫瘤過程中抗癌譜廣，毒副作用小，是一種具有良好應(yīng)用前景的抗癌新藥。姜黃素發(fā)揮抗腫瘤作用的機制有： (1)損傷細(xì)胞線粒體，使之釋放細(xì)胞色素C，活化Caspase 3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]；(2)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖，如NF-κB、Notch-1等[7]；(3)抑制腫瘤血管生長因子及其受體從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[8]；(4)阻斷TGF-β1發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞遷移的作用[9]；(5)通過抑制胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)活性，阻遏細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞分化等[10]。但PTEN/PI3K/AKT通路在姜黃素誘導(dǎo)食管癌Ec-109細(xì)胞凋亡中是否發(fā)揮作用還不明確。

本研究CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著抑制食管癌EC109細(xì)胞的增殖，且呈明顯的劑量和時間效應(yīng)關(guān)系。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，EC109細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征越來越明顯，但最高濃度120 μmol/L姜黃素作用后未形成明顯的凋亡小體，這可能和藥物濃度偏低有關(guān)。Annexin V-FITC/PI雙染激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)15～120 μmol/L姜黃素作用EC109細(xì)胞后，綠色熒光逐漸減弱，紅色熒光逐漸增強，即隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞由早期凋亡逐漸發(fā)展為晚期凋亡。

本實驗流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示姜黃素可增加細(xì)胞中PTEN 、GSK3β和Caspase 3蛋白的表達(dá)，抑制AKT的表達(dá)，其機制為姜黃素作用后上調(diào)了抑癌基因PTEN的表達(dá)，繼而PTEN使PI3K的活化產(chǎn)物PIP3去磷酸化，降低細(xì)胞內(nèi)PIP3的濃度，從而抑制了AKT的激活,使AKT的表達(dá)水平降低[11],而AKT抑制使后其下游靶基因GSK3β激活[12]，激活的GSK3β進(jìn)而調(diào)節(jié)下游相關(guān)蛋白Caspase 3[13]的表達(dá)。有研究表明Caspase 3被稱為“死亡蛋白酶”,是細(xì)胞凋亡的生物學(xué)標(biāo)志,可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,引起細(xì)胞凋亡[14]，所以15～120 μmol/L姜黃素處理EC109細(xì)胞后Caspase 3表達(dá)均顯著升高。因此，姜黃素通過調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路，激活其下游靶基因Caspase 3誘導(dǎo)了EC109細(xì)胞凋亡。

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Curcumin induces apoptosis by PTEN/PI3K/AKT pathway in EC109 cells

LI Xiu-juan△， LI Yu-zhen， JIN Chun-ting， FAN Jie， LI Hai-jun

(Department of Pathology， Hebei North University， Zhangjiakou 075000， China)

Objective: To study the molecular mechanism of curcumin in human esophageal carcinoma cell line(EC109). Methods: EC109 cells were cultivatedinvitro. When 80%-90% confluence was reached, they were treated with curcumin in different concentrations (15～120 μmol/L). The effects on cell proliferation were examined by CCK-8 colorimetry. The ultrastructure of EC109 cells were detected with transmission electron microscope(TEM). The cells apoptosis was observed with laser confocal microscope(LCM) by AnnexinV-FITC/PI double staining. The proteins level of PTEN, AKT,GSK3β and Caspase 3 were tested by flow cytometry(FCM). Results: CCK-8 test showed that curcumin could inhibit the proliferation of EC109 cells in a time-and concentration-dependent manner. TEM and LCM examinations indicated that curcumin could make EC109 cells apoptosis. The data of FCM showed that curcumin could increase the expression of PTEN, GSK3β and Caspase 3, decreased the expression of AKT. Conclusion: The effects of curcumin on inhibiting proliferation and promoting apoptosis of EC109 cells were related with increased expression of PTEN and inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.

curcumin; PTEN/PI3K/AKT pathway; esophageal carcinoma

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(ZD20140083);河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究青年基金項目(QN20131156)

2014-10-17 【修回日期】2015-01-27

R735.1

A

1000-6834(2015)02-174-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.021

△【通訊作者】Tel： 18931316332； E-mail： llxxjjuan@126.com