萬秋英， 宋麗君

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院， 恩施 445000)

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五鶴續(xù)斷總皂苷抗皮膚衰老的作用及其機(jī)制*

萬秋英， 宋麗君△

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院， 恩施 445000)

目的：研究五鶴續(xù)斷總皂苷抗皮膚衰老的作用及其機(jī)制。方法：將48只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、五鶴續(xù)斷低、中、高劑量組和陽性對照組(n=8)。采用5%D-半乳糖(0.025 ml/(g·d))頸背部皮下注射制備皮膚衰老小鼠模型，五鶴續(xù)斷低、中、高劑量組灌服五鶴續(xù)斷總皂苷水溶液(50 ml/(kg·d)、100 ml/(kg·d)、200 ml/(kg·d)), 陽性對照組灌服維生素E(50 mg/(kg·d))，連續(xù)給藥42 d后，檢測各組小鼠皮膚組織羥脯氨酸(HYP)和脂褐質(zhì)(LF)的含量，血清和皮膚組織過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性與丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果：與空白對照組比，模型組小鼠皮膚組織HYP含量明顯減少，LF含量明顯增多，血清和皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性顯著降低，MDA含量明顯增加；與模型組比，五鶴續(xù)斷低、中、高劑量和陽性對照組皮膚組織HYP含量明顯增多，LF含量明顯減少，血清和皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量明顯減少；與低劑量組比，高劑量和陽性對照組皮膚組織HYP含量明顯增多，LF含量明顯減少，血清和皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量明顯減少；血清和皮膚組織SOD活性與皮膚組織 HYP呈顯著正相關(guān)，與LF呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論：五鶴續(xù)斷總皂苷具有明顯的抗皮膚衰老作用，其作用機(jī)制與抗氧化損傷密切相關(guān)。

抗衰老；抗氧化酶；羥脯氨酸;脂褐質(zhì)；丙二醛

五鶴續(xù)斷 (dipsacus asper)為川續(xù)斷科植物續(xù)斷的干燥根，因產(chǎn)于湖北五峰縣和鶴峰縣而得名。研究證明其主要的活性成分-五鶴續(xù)斷總皂苷，具有明確改善學(xué)習(xí)記憶能力和抗氧化抗衰老的作用[3，4]。而皮膚是機(jī)體衰老過程中最易察覺的器官，皮膚的老化程度是評價人體衰老最重要的指標(biāo)[5]。為此，本文擬從延緩皮膚衰老的角度來探討其抗衰老的作用及其作用機(jī)制，旨在為本地區(qū)五鶴續(xù)斷資源的開發(fā)應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

五鶴續(xù)斷總皂苷水溶液的制備： 用95%乙醇提取五鶴續(xù)斷后, 濃縮提取液至無醇味的浸膏, 水溶解后上大孔吸附樹脂柱(AB-8型大孔樹脂,天津南開大學(xué)化工廠), 用香草醛-濃硫酸顯色反應(yīng)比色法在波長532 nm測定總皂苷的含量，并稀釋成濃度為0.72 g/L五鶴續(xù)斷總皂苷水溶液備用。D-半乳糖(上海恒信化學(xué)試劑有限公司)。過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)、脂褐質(zhì)(lipofuscin， LF)試劑盒(南京建成生物工程研究所)

1.2 主要儀器

UV-2450分光光度儀，GL-20GII型高速低溫離心機(jī)，Multikan MK3酶標(biāo)儀，DW40-120低溫冰箱，BS224S電子分析天平，HFJ-10內(nèi)切式勻漿機(jī)。

1.3 動物分組及給藥

3月齡清潔級KM雌性小鼠48只,體重(20.0±2.1)g(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心)，隨機(jī)分為6組(n=8)：空白對照組、模型組、五鶴續(xù)斷低、中、高劑量組和陽性對照組。模型組、五鶴續(xù)斷組和陽性對照組0.025 ml/(g·d)頸背部皮下注射5% D-半乳糖生理鹽水溶液,對照組頸背部皮下注射等量生理鹽水, 均連續(xù)注射42 d,造模同時,五鶴續(xù)斷低、中、高劑量組分別按50 ml/(kg·d)、100 ml/(kg·d)、200 ml/(kg·d)連續(xù)灌服五鶴續(xù)斷總皂苷水溶液, 陽性對照組連續(xù)灌服維生素E 50 mg/(kg·d)，空白對照組和模型組連續(xù)灌服等量生理鹽水，均連續(xù)給藥42 d。

1.4 血清CAT、GSH-Px、SOD、MDA的檢測

分組過程中，要充分考慮學(xué)生之間的人際關(guān)系，學(xué)生相互的個體差異，盡量讓小組分配均勻合理。避免評比還未開始，學(xué)生就產(chǎn)生負(fù)面情緒和思想。

末次給藥2 h后，將小鼠摘眼球取血，置于4℃ 冰箱靜置保存2 h后，3 000 r/min，離心10 min，取上清液，即為血清，于4℃保存血清備用。按試劑盒說明測定并計(jì)算血清CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA、HYP、LF的含量。

1.5 皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA、HYP、LF的檢測

采血后，脫頸椎處死小鼠，取1.5 cm×1.5 cm背部脫毛皮膚，去除皮下組織稱重后，冷生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，剪碎，加入冷的生理鹽水(生理鹽水的體積總量是皮膚重量的9倍)和少量蛋白裂解液,用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿(勻漿時間每次10 s，間隙30 s，連續(xù)5～6次，在冰水中進(jìn)行)，將制備好的10%勻漿用冷凍離心機(jī)3 000 r/min左右離心10～15 min，取適量離心好的勻漿上清夜，按試劑盒說明測定并計(jì)算皮膚組織中CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA、HYP、LF含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 五鶴續(xù)斷總皂苷對衰老小鼠血清CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量的影響

與對照組比較，模型組小鼠血清CAT、GSH-Px、SOD活性顯著降低，MDA含量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，五鶴續(xù)斷低、中、高劑量和陽性對照組血清CAT、GSH-Px、SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量明顯減少(P<0.05，P<0.01)；與低劑量組比較，高劑量和陽性對照組血清CAT、GSH-Px、SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量明顯減少(P<0.01，表1)。

2.2 五鶴續(xù)斷總皂苷對衰老小鼠皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量的影響

與對照組比較，模型組小鼠皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性顯著降低，MDA含量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，五鶴續(xù)斷低、中、高劑量和陽性對照組皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量明顯減少(P<0.05，P<0.01,)；與低劑量組比，高劑量和陽性對照組皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量明顯減少(P<0.01，表2)。

GroupCAT(U/ml)GSH-Px(U/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)Blankcontrol52.07±5.4034.71±2.9097.56±6.488.44±0.27Model33.16±4.81**▲▲21.20±2.67**▲▲65.42±4.21**▲▲17.12±0.76**▲▲Low-Dipsacus39.32±4.27#▲▲25.26±3.14#▲▲80.29±8.05##▲▲14.79±1.11##▲▲Medium-Dipsacus44.01±4.70##▲27.47±2.84##▲83.66±4.28##▲▲12.26±0.43##△△▲▲High-Dipsacus46.74±4.72##△△30.89±4.08##△△91.57±4.05##△△9.68±0.54##△△Positivecontrol49.68±5.38##△△31.94±4.43##△△94.36±7.83##△△9.02±0.29##△△

CAT: Catalase; GSH-Px : Glutathione peroxidase; SOD : Superoxide ; MDA : Malondialdehyde

**P<0.01vsblank control group；#P<0.05,##P<0.01vsmodel group；△△P<0.01vslow-Dipsacus;▲P<0.05,▲▲P<0.01vspositive control

GroupCAT(U/mg)GSH-Px(U/mg)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)Blankcontrol47.42±6.1928.30±4.2785.46±6.565.82±0.47Model25.56±3.80**▲▲11.45±3.85**▲▲57.18±5.63**▲▲12.99±0.66**▲▲Low-Dipsacus31.02±4.57#▲▲15.97±2.72#▲▲67.86±6.04##▲▲10.25±0.50##▲▲Medium-Dipsacus36.68±4.76##△▲17.90±2.68##▲▲72.75±6.38##▲8.26±0.48##△△▲▲High-Dipsacus42.82±5.08##△△23.48±3.51##△△80.35±6.81##△△6.53±0.44##△△Positivecontrol44.53±5.96##△△25.04±3.32##△△82.35±7.26##△△6.36±0.42##△△

CAT: Catalase; GSH-Px: Glutathione peroxidase; SOD: Superoxide; MDA: Malondialdehyde

**P<0.01vsblank control group；#P<0.05,##P<0.01vsmodel group；△P<0.05,△△P<0.01vslow-Dipsacus;▲P<0.05,▲▲P<0.01vspositive control

2.3 五鶴續(xù)斷總皂苷對衰老小鼠皮膚組織HYP、 LF含量的影響

與對照組比較，模型組小鼠皮膚組織HYP含量明顯減少，LF含量明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，五鶴續(xù)斷低、中、高劑量和陽性對照組皮膚組織HYP明顯增多，LF含量明顯減少(P<0.01)；與低劑量組比較，高劑量和陽性對照組皮膚組織HYP明顯增多，LF含量明顯減少(P<0.05 ,P<0.01，表3)。

GroupHYP(μg/mg)LF(μg/g)Blankcontrol47.82±5.184.70±0.35Model23.24±2.64*▲▲7.62±0.84*▲▲Low-Dipsacus32.56±3.35##▲▲6.15±0.61##▲▲Medium-Dipsacus34.28±3.88##▲▲5.98±0.80##▲High-Dipsacus39.20±4.42##△△▲5.43±0.60##△Positivecontrol45.36±5.74##△△5.24±0.52##△△

HYP: Hydroxyproline; LF: Lipofuscin

**P<0.01vsblank control group；##P<0.01vsmodel group；△P<0.05,△△P<0.01vslow-Dipsacus;▲P<0.05,▲▲P<0.01vspositive control

2.4 血清和皮膚組織抗氧化指標(biāo)SOD活性與皮膚衰老指標(biāo) HYP和LF的相關(guān)性分析

血清和皮膚組織SOD活性與皮膚組織 HYP呈顯著正相關(guān)((r=0.9188，P<0.01；r=0.9200，P<0.01)血清和皮膚組織SOD活性與LF呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.9891，P<0.01；r=-0.9692，P<0.01)

3 討論

HYP作為皮膚膠原蛋白和彈性蛋白中的一種主要且相對恒定的氨基酸， 可穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu), 增加纖維韌性, 使皮膚光滑、柔順、 有彈性，HYP的含量會隨著皮膚的衰老而降低[6]。研究表明LF在細(xì)胞中沉積會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，使皮膚粗糙、黯淡、無光澤，出現(xiàn)皺紋、色斑等，脂褐質(zhì)的含量與皮膚衰老和老化程度呈顯著正相關(guān)，因此，皮膚組織中HYP和LF的含量是評價皮膚衰老的可靠指標(biāo)[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量五鶴續(xù)斷總皂苷均能增加皮膚組織HYP的合成，促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)與再生，減少脂褐質(zhì)在皮膚結(jié)締組織中的累積，且高劑量組作用效果明顯強(qiáng)于低劑量組，說明五鶴續(xù)斷總皂苷能夠延緩皮膚的衰老，以高劑量組作用效果最好。

皮膚衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為，皮膚衰老與抗氧化酶的活性密切相關(guān)，生物體內(nèi)抗氧化酶(CAT、GSH-Px、SOD等)活性降低會造成自由基堆積，過多的自由基與氨基酸或直接與蛋白質(zhì)反應(yīng)使肽鍵斷裂，蛋白發(fā)生交聯(lián)變性，蛋白酶失活，尤其是成纖維細(xì)胞羥化酶損傷會出現(xiàn)羥化功能障礙，羥脯氨酸生成減少，從而破壞膠原蛋白和彈性蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，使皮膚的光潔度、柔韌性和彈性下降而出現(xiàn)衰老[8-9]。同時活性氧會攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化損傷，其產(chǎn)物MDA會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，形成脂褐質(zhì)(LF)[10]。

本研究結(jié)果顯示三種劑量的五鶴續(xù)斷總皂苷都能顯著提高機(jī)體抗氧化酶的活性，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成，且高劑量作用最強(qiáng)，以SOD活性為例，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清和皮膚組織抗氧化指標(biāo)與皮膚組織 HYP呈顯著正相關(guān)，與LF呈顯著負(fù)相關(guān)，提示五鶴續(xù)斷總皂苷抗皮膚衰老作用的機(jī)制與其抗氧化損傷密切相關(guān)。

[1] Sachs DL, Rittié L, Chubb HA,etal． Hypo-collagenesis in photoaged skin predicts response to anti-aging cosmeceuticals[J]．JCosmetDermatol， 2013， 12(2)： 108-115．

[2] Nkengne A, Roure R, Rossi AB,etal．The skin aging index: a new approach for documenting anti-aging products or procedures[J]．SkinResTechnol， 2013， 19(3)： 291-298．

[3] Yu X, Wang LN, Du QM,etal． Akebia Saponin D attenuates amyloid β-induced cognitive deficits and inflammatory response in rats: involvement of Akt/NF-κB pathway[J]．BehavBrainRes， 2012， 235(2)： 200-209．

[4] Li C, Gao Y, Tian J,etal． Long-term oral Asperosaponin VI attenuates cardiac dysfunction, myocardial fibrosis in a rat model of chronic myocardial infarction[J]．FoodChemToxicol， 2012， 50(5)： 1432-1438．

[5] 房 林, 趙振民． 皮膚衰老機(jī)制的研究進(jìn)展[J]． 人民軍醫(yī)， 2010， 53(2)： 149-152．

[6] 譚文波， 盧義紅， 譚 剛. 木瓜黃酮的抗皮膚衰老作用[J]. 中國老年學(xué)雜志，2012， 32(23): 5218-5219.

[7] 王 方， 王 燦． 白芷醇提物延緩皮膚衰老與抗氧化作用的相關(guān)性研究[J]．中國藥房， 2012， 23(7)： 599-602．

[8] Knaggs H． A new source of aging [J]?JCosmetDermatol， 2009， 8(2)： 77-82．

[9] Koziel R, Greussing R, Maier AB,etal． Functional interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging[J]．JInvestDermatol， 2011， 131(3)： 594-603．

[10]高瑞英, 張秀宇, 慕 丹， 等． 中草藥提取物復(fù)配化妝品乳液延緩皮膚衰老實(shí)驗(yàn)研究[J]． 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2010， 29(7)： 857-860．

Study of anti-aging effect and its mechanism of total saponins of Wu-He Dipsacus asper on skin of mouse-aging model

WAN Qiu-ying， SONG Li-jun△

(Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

Objective: To Study the effect of anti-aging and its mechanism of total saponins of Wu-He Dipsacus asper on skin of mice-aging model． Methods: Forty-eight mice were randomly divided into blank control group, model group，low-Dipsacus group, medium-Dipsacus group, high-Dipsacus group and positive control group(n=8). The mouse model of skin aging was established by nape subcutaneous injection of 5%D-galactose (0.025 ml/(g·d)), the mouse of low-Dipsacus group ,medium-Dipsacus group,high-Dipsacus group were administered with total saponins of Wu-He Dipsacus asper( 50 ml/(kg·d), 100 ml/(kg·d), 200 ml/(kg·d)), the mice of the positive control group were administered with vitamin E(50 mg/(kg·d))for 42 d. The content of hydroxyproline (HYP) and lipofuscin (LF) were measured in skin of each group mice, the activity of catalase (CAT)、glutathione peroxidase ( GSH-Px)、superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) were determined in serum and skin of each group mice. Results: Compared with blank control group, the content of HYP decreased significantly and the content of LF increased significantly in skin, the activities of CAT, GSH-Px and SOD decreased significantly and the content of MDA increased significantly in serum and skin of model group; Compared with model group, the content of HYP increased significantly and the content of LF decreased significantly in skin, the activities of CAT, GSH-Px and SOD enhanced significantly and the content of MDA decreased significantly in serum and skin of low-Dipsacus group, medium-Dipsacus group,high-Dipsacus group and positive control group;Compared with low-Dipsacus group, the content of HYP increased significantly and the content of LF decreased significantly in skin, the activities of CAT, GSH-Px and SOD enhanced significantly and the content of MDA decreased significantly in serum and skin of high-Dipsacus group and positive control group; The activity of SOD in serum and skin had a significant positive correlation with the content of HYP, and a significant negative correlation with LF in skin. Conclusion: Total saponins of Wu-He Dipsacus asper have obvious effect of anti-agng on skin of mouse-aging model , its mechanism is closely related to oxidative damage.

anti-aging; antioxidase； hydroxyproline； lipofuscin； malondialdehyde

2014-07-10

2015-02-03

R285.5

A

1000-6834(2015)02-166-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.019

△【通訊作者】Tel： 15671534176; E-mail： 907903154@qq.com