邱 楓， 曾 杰， 李 坤， 陳愛君， 徐萬祥， 倪 崖△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035； 2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心， 杭州 310013；3. 上海計(jì)劃生育研究所國家人口和計(jì)劃生育避孕藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200032)

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定量檢測囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子BA-ELISA方法的建立與評(píng)價(jià)*

邱 楓1,2， 曾 杰1,2， 李 坤2， 陳愛君2， 徐萬祥3， 倪 崖1,2△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035； 2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心， 杭州 310013；3. 上海計(jì)劃生育研究所國家人口和計(jì)劃生育避孕藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200032)

目的：建立一種定量檢測囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)的生物素-親和素ELISA(BA-ELISA)方法并評(píng)價(jià)其可靠性。方法：優(yōu)選設(shè)計(jì)CFTR三個(gè)表位的大腸桿菌表達(dá)抗原，免疫新西蘭白兔獲得CFTR多克隆抗體，用純化后的抗體包被酶標(biāo)板，并用生物素對(duì)其標(biāo)記，從人精子提取CFTR作為抗原，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的親和素檢測，優(yōu)化兩種抗體濃度及實(shí)驗(yàn)參數(shù) ，建立可定量檢測CFTR蛋白的雙抗體夾心BA-ELISA方法；用臨床精子標(biāo)本評(píng)估所建立方法的重復(fù)性、特異性等。結(jié)果：CFTR包被抗體和生物素化CFTR抗體最適濃度分別為4 μg/ml和 10 μg/ml，最佳封閉液為1% BSA-PBST，抗原與包被抗體最佳反應(yīng)時(shí)間60 min，底物顯色最佳時(shí)間15 min。批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為2.16%～9.23%和 2.29%～11.71%，包被的CFTR抗體與精子胞漿蛋白無交叉反應(yīng)，最低檢出下限為0.15 ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線具有良好的線性關(guān)系R2=0.962。結(jié)論：成功創(chuàng)建了定量檢測CFTR蛋白的ELISA方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。

CFTR蛋白；CFTR多克隆抗體；生物素-親和素ELISA

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)是一種cAMP激活氯離子通道，其基因突變可致常染色體隱性遺傳病——囊性纖維化(cystic fibrosis, CF)，CF常伴有多種疾病，如胰功能不全、男性不育等。近97%男性CF患者因先天雙側(cè)輸精管缺失(congenital bilateral absence of the vas deferens, CBAVD)導(dǎo)致梗阻性無精子癥[1,2]，CBAVD患者CFTR突變率很高，并呈現(xiàn)明顯的種族差異性[3]；本課題組前期發(fā)現(xiàn)CFTR通道蛋白存在于生育男子精子頭部且對(duì)男性生殖功能和精子受精能力至關(guān)重要[4]，隨后我們進(jìn)一步證明CFTR蛋白水平與人精子受精能力呈正相關(guān)，為評(píng)價(jià)精子受精能力的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)[5]，另外，有些疾病如男性尿毒癥患者精子CFTR表達(dá)率顯著下降，精子CFTR表達(dá)率也可作為評(píng)價(jià)男性尿毒癥患者生育力的指標(biāo)[6]。目前臨床上常用來評(píng)價(jià)精子受精能力的方法僅有精液常規(guī)檢查等幾項(xiàng)，尚缺乏與精子受精相關(guān)的更多檢測指標(biāo)，且只靠精液常規(guī)等檢測方法并不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)精子受精能力，因此創(chuàng)建一種性能可靠定量檢測CFTR蛋白的方法非常必要。本研究對(duì)設(shè)計(jì)構(gòu)建的CFTR工程菌表達(dá)抗原免疫兔獲得的多克隆抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記，利用生物素—親和素系統(tǒng)，建立一種特異性好、靈敏度高、方便快捷檢測CFTR蛋白的BA-ELISA方法，為CF診斷治療、精子質(zhì)量評(píng)價(jià)與男性不育臨床診斷、精子庫精子篩查以及科學(xué)研究提供新的檢測技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

兔抗CFTR多克隆血清由本實(shí)驗(yàn)室和上海計(jì)劃生育研究所合作制備，活化生物素、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素、96孔酶標(biāo)板、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所； 3,3，5,5，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司；生物素化兔抗人CFTR抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備；HiTrap Protein A抗體純化柱購自美國GE公司；精液標(biāo)本由志愿者提供，CFTR抗原從精子中提取；囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白ELISA參考試劑盒購自BG公司；MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自Thermo公司；透析袋；電磁攪拌器。

1.2 CFTR抗體的制備和純化

準(zhǔn)備2 ml HiTrap Protein A抗體純化柱，按說明書純化抗體，用BCA試劑盒測純化后抗體濃度。

1.3 生物素標(biāo)記CFTR抗體的制備

將純化過的CFTR抗體用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)充分透析后測蛋白濃度。按CFTR抗體與NHSB質(zhì)量比10∶3加入NHSB溶液(N-羥基琥珀酰亞胺生物素1 mg溶于1 ml二亞基甲砜)，室溫下持續(xù)攪拌、保溫2～4 h。加入9.6 μg 1 mol/L NH4Cl，室溫?cái)嚢?0 min后放在透析袋中，在4℃對(duì)PBS充分透析后，用BCA試劑盒測生物素化抗體濃度，置于-20℃保存。

1.4 CFTR蛋白抗原提取及濃度測定

精子標(biāo)本鏡檢后離心去精漿，充分洗滌精子；加入少量PBS混勻放入液氮中反復(fù)凍融并用1 ml注射器反復(fù)吹打直至在顯微鏡下觀察精子破裂程度大于80%，4℃ 13 000 r/min離心10 min，取上清。依據(jù)囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白ELISA參考試劑盒說明書測定以上提取蛋白總濃度及CFTR蛋白濃度。

1.5 CFTR蛋白雙抗體夾心ELISA方法的建立與優(yōu)化

1.5.1 包被抗體濃度和生物素化抗體最適濃度的優(yōu)化 將純化的CFTR抗體IgG用pH 9.6 碳酸鹽緩沖液分別稀釋3個(gè)不同濃度，每一濃度包括3個(gè)橫行，4℃孵育16 h，洗滌；每孔加入100 μl 1% BSA-PBST封閉，37℃孵育1 h；在3個(gè)縱行中依次加入以上提取的濃度從大到小的含CFTR蛋白的提取液，第4縱行中加入PBST為陰性對(duì)照，37℃孵育1 h，洗滌；生物素化抗體稀釋成3個(gè)不同濃度，分別加100 μl于每一包被濃度的一個(gè)縱行中，37℃孵育1 h，洗滌；每孔加100 μl 1：2 000稀釋終濃度為0.5 μg/ml辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，37℃孵育0.5 h，加底物37℃避光顯色15 min；加終止液終止反應(yīng)后在450 nm波長下讀取吸光度A值，以陰性對(duì)照OD值小于0.1，陽性O(shè)D450nm/陰性O(shè)D450nm(P/N)最大時(shí)的一組作為包被抗體和生物素化抗體的最適工作濃度。

1.5.2 封閉液、抗原與包被抗體最佳反應(yīng)時(shí)間和底物最佳顯色時(shí)間的優(yōu)化 按1.5.1方法， CFTR抗原與包被抗體反應(yīng)，分別采用不同的封閉液封閉酶標(biāo)板選擇最佳封閉液；分別反應(yīng)不同時(shí)間，確定抗原抗體最佳反應(yīng)時(shí)間； 改變底物顯色時(shí)間，確定底物最佳顯色時(shí)間；包被抗體和生物素化抗體分別選取1.5.1方法中最適最佳工作濃度，以陰性O(shè)D值小于0.1， P/N最大判定以上最佳條件。

1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性：檢測不同濃度的CFTR蛋白，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔，每個(gè)濃度重復(fù)5孔，讀出每孔OD值，計(jì)算其孔間變異系數(shù)CV%值。

批間重復(fù)性：按批內(nèi)重復(fù)性方法，連續(xù)5 d測其OD值，計(jì)算其板間變異系數(shù)CV%值。

1.5.4 特異性試驗(yàn) 用不含CFTR蛋白的精子胞漿蛋白作為抗原與包被抗體反應(yīng)，在450 nm波長下分別讀取CFTR蛋白和精子胞漿蛋白的吸光度A值。1.5.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測線的確定 已知濃度的CFTR蛋白倍比稀釋為5個(gè)不同濃度：1.2 ng/ml、0.6 ng/ml、0.3 ng/ml、0.15 ng/ml和0.075 ng/ml分別與包被抗體反應(yīng)，測定各孔的OD450nm值。取陽性/陰性(P/N)≥2.1時(shí)的最大稀釋倍數(shù)所對(duì)應(yīng)的濃度為待檢抗原的最低檢出量，并根據(jù)CFTR蛋白的量和各自對(duì)應(yīng)的OD450nm做標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 提取精子CFTR蛋白抗原的濃度

按囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白ELISA參考試劑盒說明書操作，所得CFTR蛋白濃度為1.2 ng/ml。

2.2 包被抗體和生物素抗體最適工作濃度

用3種不同濃度的CFTR抗體與3個(gè)不同濃度的CFTR生物素抗體兩兩組合，分別檢測以上提取的濃度從大到小含CFTR蛋白的提取液，結(jié)果顯示當(dāng)包被抗體濃度為10 μg/ml，生物素抗體濃度為10 μg/ml時(shí)P/N值最大，但其線性關(guān)系欠佳，故確定包被抗體的最適工作濃度為4 μg/ml，生物素抗體的最適工作濃度為10 μg/ml(表1)。

2.3 最適封閉液、待測抗原與包被抗體最適反應(yīng)時(shí)間和底物最佳顯色條件的確定

分別用不同的封閉液進(jìn)行封閉，最終確定1%BSA-PBST封閉效果最好(表2)。

Tab. 1 Optimization of the working concentrations of coated anti-CFTR antibodies and anti-CFTR antibodies labeled with Biotin

CFTR: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

Pis OD450nmof each well, andNis OD450nmof negative control (PBST)

Tab. 2 The optimization of blocking buffers

Pis OD450nmof each well, andNis OD450nmof negative control (PBST)

CFTR抗原與包被抗體反應(yīng)60 min時(shí)P/N值最大，選擇60 min為最佳反應(yīng)時(shí)間(表3)。

Tab. 3 The optimization of time during the reaction between CFTR antigen and its coated antibodies

Reactiontime30min60min90min120minP0.2400.3440.2800.128N0.0470.0440.0480.047P/N5.2127.8675.7452.729

Pis OD450nmof each well, andNis OD450nmof negative control (PBST)

對(duì)不同底物顯色時(shí)間的P/N值比較，最終確定15 min為最佳顯色時(shí)間(表4)。

Tab. 4 Determination for optimum conditions of substrate chromogenic reaction

Chromogenictime10min12min15min20minP0.9500.1030.1240.115N0.5000.0490.0500.050P/N1.9002.0602.4002.300

Pis OD450nmof each well, andNis OD450nmof negative control (PBST)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

用同一批制備的抗體包被酶標(biāo)板，取4份濃度不同的CFTR蛋白樣品各測定5孔。其批內(nèi)CV分別為3.82%、5.02%、9.23%和7.14%。取3份濃度不同的CFTR蛋白連續(xù)測定5 d， 批間CV分別為2.29%、5.35%和11.71%。

2.5 雙抗體夾心ELISA交叉試驗(yàn)結(jié)果

CFTR抗原用PBST稀釋為0.3 ng/ml，精子胞漿蛋白濃度為192 μg/ml，用本研究所建立方法檢測精子胞漿蛋白呈陰性反應(yīng)。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測線的確定

2.6.1 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 如表5所示，當(dāng)CFTR抗原濃度為0.075 ng/ml時(shí)，P/N值開始小于2.1。即本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測CFTR的最低檢出量為0.15 ng/ml。

Tab. 5 Results of sensitivity test

WhenP/N>2.1, the result is positive, the value ofNis 0.05

2.7 標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度與吸光度的相關(guān)性

如圖1，回歸方程為y=0.7438x+0.0636，相關(guān)系數(shù)R2=0.9619，可見標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度與其OD值顯著相關(guān)，表明建立的生物素—親和素雙抗體夾心ELISA法定量檢測CFTR蛋白含量是可行的。

Fig. 1 The correlation of standard antigen concentration and the absorbance

3 討論

本研究主要采用以下手段提高其檢測技術(shù)的靈敏度、特異性和可靠性：(1)制備的CFTR抗體含CFTR 3個(gè)表位抗原的多克隆抗體，具有與CFTR抗原3個(gè)表位特異反應(yīng)的特點(diǎn)，克服了由于CFTR基因突變?cè)斐赡骋槐砦皇Щ疃箚慰篃o法識(shí)別抗原的問題；(2)3個(gè)表位的設(shè)計(jì)，確保了雙抗體夾心法中抗原的結(jié)合需要針對(duì)兩個(gè)不同表位的要求；(3)優(yōu)選的3個(gè)表位為已報(bào)道的功能肽段，且其長度適合在大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)以及表達(dá)后的SDS-PAGE分析；(4)制備的多克隆抗血清效價(jià)高(1∶512 000)，可有效地檢測到人精子中的CFTR蛋白，保證定量檢測方法的高靈敏度和特異性；(5)利用生物素—親和素系統(tǒng)具有高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性和容易標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，所以本方法克服了目前市場上常用的酶聯(lián)免疫競爭法敏感性和特異性較差的問題；(6)一般酶聯(lián)免疫競爭法適合小分子蛋白的檢測，而CFTR蛋白為170 KD的大分子蛋白，因此更適合用雙抗體夾心法檢測。上述優(yōu)點(diǎn)集合在一起，保證了檢測的靈敏和快速，本研究對(duì)制備的CFTR 多克隆抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記，探索了抗體封閉條件、待測抗原反應(yīng)時(shí)間和底物最適作用時(shí)間等檢測技術(shù)參數(shù)，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)優(yōu)化選擇，最終創(chuàng)建了針對(duì)CFTR檢測的生物素—親和素雙抗體夾心ELISA方法。

對(duì)本研究建立的BA-ELISA檢測CFTR方法進(jìn)行了性能驗(yàn)證，檢測下限為0.15 ng/ml，具有較高的靈敏度；交叉實(shí)驗(yàn)，證明具有良好的特異性；批內(nèi)、批間誤差實(shí)驗(yàn)，證明具有較好的重復(fù)性。本研究成功建立了定量檢測CFTR蛋白的BA-ELISA方法，能定量檢測出組織和細(xì)胞中的CFTR蛋白，且在檢測靈敏度和檢測陽性率方面均優(yōu)于常規(guī)ELISA方法[7]，為CFTR的研究和應(yīng)用提供了有效的檢測手段。

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Establishment and evaluation of methods for determinating cystic fibrosis transmembrane conductance regulator quantitatively

QIU Feng1, 2， ZENG Jie1,2， LI Kun2， CHEN Ai-jun2， XU Wan-xiang3， NI Ya1,2△

(1. School of Medical Laboratory Science, School of Life Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035; 2. Center of Reproductive Medicine, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013; 3. National Population and Family Planning Key Laboratory of Contraceptive Drugs and Devices, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China)

Objective: To establish and evaluate a BA-ELISA method for the quantitative detection of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein．Methods: We deliberately selected three tables of CFTR and made the synthetic peptide be expressed in E.coli, then used the antigen to immunize rabbits to obtain the anti-CFTR polyclonal serum. After that, 96 well plates were coated with the purified antibody against CFTR. The antigen CFTR which was extracted from human sperm was detected by anti-CFTR antibody labeled with biotin, horseradish peroxidase conjugated avidin, and the substrate. The concentrations of two kinds of antibodies and the experiment parameters were optimized. Thereby, the double antibody sandwich BA-ELISA method for the quantitative detection of CFTR protein was established. Furthermore, the reproducibility, specificity and so on were evaluated by clinical specimens of sperm. Results: The optimal concentration of coated anti-CFTR IgG was 4 μg/ml, while the biotin labeled anti-CFTR IgG was 10 μg/ml; the optimal blocking buffer was 1%BSA-PBST, the optimal time of the reaction between antigen and antibody was 60 min, the optimal chromogenic time was 15 min, the intra-assay and inter-assay coefficient were 2.16%～9.23% and 2.29%～11.71% respectively; The lowest detectable limit was 0.15 ng/ml; the standard curve had a good linear correlation of R2=0.962. Conclusion: The BA-ELISA method for the quantitative detection of CTFR protein is successfully established, and it is demonstrated that the method has strong specificity, high sensitivity and good reproducibility. It provides the basis and evidence of the further application of the method.

CFTR protein; anti-CFTR polyclonal serum; biotin-avidin ELISA

浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2012R10048-07)；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011C23046,2013C31066,2012F10004)

2014-10-24 【修回日期】2015-01-30

R392-33

A

1000-6834(2015)02-154-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.016

△【通訊作者】Tel： 0571-88215505; E-mail: niya99@126.com