顏 暢， 胡藝冰， 穆 磊， 黃開禹， 覃吉超△

BMP4增強(qiáng)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞化療敏感性的作用及機(jī)制＊

顏 暢1， 胡藝冰2， 穆 磊1， 黃開禹1， 覃吉超1△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1分子醫(yī)學(xué)中心2甲乳外科，武漢 430030

目的 研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）對結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞化療敏感性的影響及機(jī)制。方法 采用5-氟尿嘧啶（5-Fu）處理結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo，建立耐藥細(xì)胞株LoVo／5-Fu；通過CCK-8法檢測LoVo／5-Fu細(xì)胞和親本細(xì)胞對5-Fu、奧沙利鉑或伊立替康的敏感性，并檢測不同濃度BMP4對LoVo／5-Fu細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)；用5-Fu聯(lián)合BMP4處理LoVo／5-Fu細(xì)胞3d，采用Annexin-Ⅴ／PI法檢測5-Fu聯(lián)合BMP4處理后LoVo／5-Fu細(xì)胞的凋亡情況；通過裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)觀察BMP4在體內(nèi)對LoVo／5-Fu細(xì)胞化療敏感性的影響；采用Western blot檢測BMP4處理后LoVo／5-Fu細(xì)胞中AKT信號通路活性和Bcl-2的蛋白水平。結(jié)果 5-Fu誘導(dǎo)形成的耐藥細(xì)胞株LoVo／5-Fu可以在含5μg／mL 5-Fu的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長，并對奧沙利鉑和伊立替康有交叉耐藥；BMP4可以抑制LoVo／5-Fu細(xì)胞的生長，抑制效應(yīng)呈時(shí)間和濃度依賴性；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示BMP4可以促進(jìn)培養(yǎng)在含5μg／mL 5-Fu培養(yǎng)液中的LoVo／5-Fu細(xì)胞發(fā)生凋亡；裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示BMP4可以有效增強(qiáng)LoVo／5-Fu細(xì)胞在體內(nèi)的對5-Fu的敏感性，抑制其在裸鼠體內(nèi)的生長；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)BMP4可以抑制LoVo／5-Fu細(xì)胞中AKT的磷酸化，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。結(jié)論 BMP4可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞對化療的敏感性；其機(jī)制有可能是通過抑制細(xì)胞中AKT通路的活性和Bcl-2表達(dá)，降低細(xì)胞抵抗凋亡的能力。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4； 結(jié)直腸癌； 多藥耐藥； 化療敏感性； 細(xì)胞凋亡

2015年公布的世界癌癥數(shù)據(jù)顯示，在2012年中結(jié)直腸癌的新發(fā)病例為1 400萬，仍是世界發(fā)病率前三的腫瘤［1］。在過去的幾十年中，由于腫瘤研究的深入和外科治療的發(fā)展，結(jié)直腸癌的診斷和治療得到了長足的發(fā)展，但是，仍有相當(dāng)一部分患者在治療過程中由于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性（multidrug-resistance，MDR）導(dǎo)致治療失敗。

MDR的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如多發(fā)性耐藥蛋白（multidrug resistance protein 1，MDR1）、人腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2（ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）、Bcl-2等。而MDR形成的機(jī)制和解決方式是當(dāng)前化療中亟須研究和解決的難題。通過調(diào)節(jié)這些基因或蛋白表達(dá)，可以增強(qiáng)這些耐藥細(xì)胞的化療敏感性，改善患者預(yù)后。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），除BMP1外其余均屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族，其中BMP4可以抑制腫瘤生長［2］。近期更有少量研究發(fā)現(xiàn)，BMP4可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化為分化細(xì)胞［3］。而現(xiàn)在的研究證明腫瘤干細(xì)胞具有自發(fā)性耐藥的特征，在腫瘤耐藥中也具有重要的作用［4］。因此，我們猜想，BMP4或許可以增強(qiáng)具有MDR特性的細(xì)胞對化療的敏感性，并在本研究探索了BMP4對化療耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo來源于本實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動物為4周齡雌性裸鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部SPF級動物中心飼養(yǎng)。BMP4、5-Fu、奧沙利鉑、伊立替康和二甲基亞砜均購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展公司，基質(zhì)膠購于美國BD公司，小鼠抗人GAPDH、AKT、磷酸化AKT（pAKT）和Bcl-2抗體購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和耐藥細(xì)胞系的建立

LoVo細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。采用含5-Fu的培養(yǎng)液持續(xù)處理LoVo細(xì)胞，5-Fu濃度從0.5μg／mL逐漸遞增，持續(xù)培養(yǎng)12周后，可見細(xì)胞在5-Fu濃度為5μg／mL的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。

1.3 細(xì)胞活性或數(shù)目測定

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配置成細(xì)胞密度為30 000／mL的單細(xì)胞懸液，接種到96孔板（3 000個(gè)細(xì)胞／孔），培養(yǎng)12h后，加入不同濃度或不同類型的藥物，并設(shè)置4個(gè)復(fù)孔和陰性對照。持續(xù)藥物作用72h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h后，用臺式酶標(biāo)儀于450nm處檢測吸光度值。計(jì)算IC50，即細(xì)胞數(shù)量為對照組細(xì)胞數(shù)量50%時(shí)的藥物濃度，耐藥倍數(shù)（RI）＝耐藥細(xì)胞IC50／親本細(xì)胞IC50。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測

取50 000個(gè)LoVo／5-Fu細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)于含5μg／mL 5-Fu的培養(yǎng)液中。待細(xì)胞貼壁后，加入100ng／mL BMP4或?qū)φ?，持續(xù)培養(yǎng)3 d后收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒說明書，用Annexin-Ⅴ（FITC）和碘化丙啶（PI）標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測

用NP40溶液裂解細(xì)胞獲得總蛋白樣品，行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），PVDF膜轉(zhuǎn)膜并以脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合，然后依次孵育一抗及抗小鼠二抗，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。最后，用ECL顯色液曝光顯影，凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)。

1.6 動物實(shí)驗(yàn)

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用PBS溶液重懸至20 000／mL，與基質(zhì)膠1∶1混勻后，注射至裸鼠兩側(cè)背部（100μL／注射點(diǎn)）。每3天小鼠經(jīng)腹腔注射5-Fu（100mg／kg），待形成腫瘤后，每3天經(jīng)瘤內(nèi)注射100ng BMP4并觀察和記錄腫瘤體積（腫瘤體積＝長徑2×短徑／2）。接種35d后收獲腫瘤并稱量腫瘤重量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LoVo／5-Fu細(xì)胞株的建立

采用藥物濃度梯度遞增的方法，LoVo細(xì)胞經(jīng)過5-Fu持續(xù)處理12周后，可在5-Fu濃度為5μg／mL的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長，即成功建立耐藥細(xì)胞株LoVo／5-Fu。通過應(yīng)用濃度梯度遞增的化療藥物處理LoVo／5-Fu細(xì)胞和親本細(xì)胞，檢測不同藥物IC50，發(fā)現(xiàn)LoVo／5-Fu細(xì)胞不僅對5-Fu耐藥，對結(jié)直腸癌常規(guī)化療藥物奧沙利鉑和伊立替康也具有交叉耐藥，5-Fu、奧沙利鉑、伊立替康的RI分別為8.57、6.24、2.16。結(jié)果提示，LoVo／5-Fu細(xì)胞有多藥耐藥（MDR）的特性。

2.2 BMP4對LoVo／5-Fu細(xì)胞的生長抑制作用及化療增敏作用

通過用不同濃度的BMP4處理LoVo／5-Fu細(xì)胞，結(jié)果顯示，BMP4對LoVo／5-Fu細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)呈時(shí)間和濃度依賴性，在BMP4濃度為100 ng／mL時(shí)效應(yīng)最為顯著（圖1）；在培養(yǎng)于含5μg／mL 5-Fu培養(yǎng)液的LoVo／5-Fu細(xì)胞中加入100 ng／mL BMP4，結(jié)果顯示，LoVo／5-Fu細(xì)胞在5-Fu濃度為5μg／mL的培養(yǎng)液中未見明顯凋亡，加入BMP4后細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖2）；在裸鼠背部接種LoVo／5-Fu細(xì)胞，并用5-Fu維持化療，發(fā)現(xiàn)BMP4治療組的腫瘤生長速度和腫瘤重量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。以上結(jié)果提示，BMP4可以抑制結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞的增殖，并在體內(nèi)和體外均可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞對化療的敏感性。

圖1 BMP4對LoVo／5-Fu細(xì)胞的生長抑制作用Fig.1 Growth inhibitory effect of BMP4on LoVo／5-Fu cells

圖2 流式細(xì)胞儀檢測BMP4處理后LoVo／5-Fu細(xì)胞的凋亡Fig.2 Flow cytometry analysis of the apoptosis of LoVo／5－Fu cells treated by BMP4

2.3 BMP4增強(qiáng)LoVo／5-Fu細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制

用100ng／mL BMP4處理LoVo／5-Fu細(xì)胞3d后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測顯示，BMP4處理后LoVo／5-Fu細(xì)胞中的pAKT和Bcl-2的表達(dá)降低（圖4）。結(jié)果提示，BMP4可以抑制AKT信號通路和Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞的抗凋亡能力。

圖3 BMP4處理后小鼠體內(nèi)的腫瘤生長曲線和重量Fig.3 Growth curves and weights of xenograft tumors in micetreated with BMP4

圖4 Western blot檢測BMP4對LoVo／5-Fu細(xì)胞中AKT信號通路和Bcl-2的影響Fig.4 Western blot analysis of the effect of BMP4on the AKT pathway and Bcl-2expression in LoVo／5-Fu cells

3 討論

化療是結(jié)直腸癌綜合治療的重要部分。到目前為止，如何提高化療療效以及降低腫瘤的耐藥能力是許多研究的熱點(diǎn)。本研究通過5-Fu誘導(dǎo)形成多藥耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞，采用BMP4處理耐藥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BMP4在體外可以抑制耐藥細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)細(xì)胞對5-Fu的敏感性。我們在動物體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，用BMP4處理5-Fu維持化療的小鼠可明顯觀察到其抑制腫瘤的生長。

BMP4是TGF-β超家族中的一員，它可以激活TGF-β／Smad信號通路，也可以通過其他非經(jīng)典通路影響PI3K／AKT和Wnt信號通路活性［5］。我們的結(jié)果顯示，BMP4可以抑制AKT的磷酸化，從而抑制PI3K／AKT信號通路。而PI3K／AKT信號通路是調(diào)控腫瘤增殖和凋亡的重要信號通路，它可以通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡，如磷酸化BAD（Bcl-2-associated death promoter）蛋白或Par-4（Prostate apoptosis response-4）蛋白，抑制其促進(jìn)凋亡的功能；激活NF-κB信號通路增強(qiáng)Bcl-2家族成員的表達(dá)［6］。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)了BMP4處理后細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)也明顯降低。

目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，藥物的聯(lián)合治療可以提高結(jié)直腸癌的生存，改善患者預(yù)后［7］。并且也有研究發(fā)現(xiàn)，BMP4可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化為非腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞，從而增強(qiáng)化療藥物對腫瘤干細(xì)胞的殺傷能力［8］。總的來說，本研究證實(shí)了BMP4可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞對化療的敏感性，其機(jī)制有可能是通過抑制PI3K／AKT信號通路和Bcl-2的表達(dá)。提示，BMP4有可能作為新的藥物應(yīng)用于臨床，增強(qiáng)化療藥物的作用，改善患者的預(yù)后。

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（2015-02-27 收稿）

BMP4 Enhances the Chemosensitivity of Drug-resistant Colorectal Cancer Cells

Yan Chang1，Hu Yibing2，Mu Lei1et al
1Molecular Medicine Center／Department of General Surgery，2Department of Thyroid and Breast Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the influence of bone morphogenetic protein 4（BMP4）on the chemosensitivity of drugresistant colorectal cancer cells.Methods Human drug-resistant colon cancer cell line，LoVo／5-Fu，was established by continuous exposure to 5-Fu.CCK-8assay was used to evaluate the chemosensitivity of drug-resistant and parent cells to 5-Fu，oxaliplatin or irinotecan，and the growth inhibitory effect of gradient concentrations of BMP4on LoVo／5-Fu cells.Annexin V／PI assay was employed to detect the apoptosis of LoVo／5-Fu cells treated with BMP4and 5-Fu for 3days.Tumorigenicity assay was used to investigate the effect of BMP4on chemosensitivity of LoVo／5-Fu cells in vivo.Western blot was performed to detect the activity of AKT pathway and the expression of Bcl-2.Results LoVo／5-Fu cells could stably grow in the culture medium containing 5μg／mL 5-Fu，and showed a cross resistance to oxaliplatin and irinotecan.CCK-8assay revealed that BMP4inhibited cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner.Moreover，BMP4could induce the apoptosis of LoVo／5-Fu cells treated by 5μg／mL 5-Fu.It enhanced chemotherapeutic sensitivity of LoVo／5-Fu cells in vivo and suppressed tumor growth.Western blot revealed that BMP4inhibited the activity of AKT pathway and the expression of Bcl-2.Conclusion BMP4 enhances the chemosensitivity of drug-resistant colorectal cancer cells possibly by inhibiting the activity AKT pathway and the expression of Bcl-2and reducing the ability of cells against apoptosis.

bone morphogenetic protein 4（BMP4）； colorectal cancer； multidrug resistance； chemosensitivity； apoptosis

R735.3

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.008

＊國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81172065）

顏 暢，男，1989年生，博士研究生，E－mail:yanchangforever＠163.com△

，Corresponding author，E-mail:jcqin＠tjh.tjmu.edu.cn