張建芳， 陳 欣， 王 偉， 方 茜， 羅愛林， 周碧云

異氟烷通過激活Calpain影響大鼠海馬神經(jīng)干細胞的增殖與分化＊

張建芳， 陳 欣， 王 偉， 方 茜， 羅愛林， 周碧云△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院麻醉科，武漢 430030

目的 探討異氟烷影響神經(jīng)干細胞（NSCs）增殖與分化的機制。方法 原代培養(yǎng)SD新生大鼠（出生1d內(nèi)）海馬NSCs，取傳至第2代細胞，將其隨機分為4組（n＝5）:空白對照組（CON），給予含有21%O2和5%CO2的混合氣體；異氟烷組（ISO），給予3.4%異氟烷，干預6h；Calpeptin組（CP），給予10μmol／L Calpeptin和含有21%O2和5%CO2的混合氣體，干預6h；異氟烷＋Calpeptin組（ISO＋CP），給予10μmol／L Calpeptin和3.4%異氟烷，干預6h。BrdU檢測NSCs增殖，Western blot檢測GFAP、Tuj-1、αⅡ-spectrin及其裂解產(chǎn)物SBDP145的蛋白水平。結果 與CON組相比，ISO組在干預后0、12、24h時BrdU＋細胞數(shù)目明顯減少，說明異氟烷抑制了NSCs增殖并有后遺效應；ISO組SBDP145表達明顯上調(diào)，說明異氟烷可上調(diào)Calpain活性。摻入Calpain抑制劑Calpeptin后，與ISO組相比，ISO＋CP組SBDP145表達量明顯下降，表明Calpeptin可拮抗異氟烷致Calpain活性增強的作用；ISO＋CP組BrdU＋細胞數(shù)目增多，Calpeptin減弱了異氟烷抑制NSCs增殖的作用。與CON組相比，ISO組GFAP表達水平上調(diào)，Tuj-1水平無明顯改變；CP組GFAP水平無明顯改變，而Tuj-1表達上調(diào)。與ISO組相比，ISO＋CP組GFAP水平降低，Tuj-1水平無明顯改變，表明異氟烷促進NSCs分化為膠質(zhì)細胞，而Calpeptin可拮抗異氟烷的這種作用。結論 異氟烷通過激活Calpain信號通路抑制NSCs的自我更新并促進NSCs分化為膠質(zhì)細胞。

Calpain； 異氟烷； 神經(jīng)干細胞； 細胞增殖； 細胞分化

吸入麻醉藥廣泛應用于小兒麻醉。然而近年臨床及基礎研究表明，全身麻醉可導致嬰幼兒學習記憶功能障礙［1］。在大腦發(fā)育及學習記憶功能正常形成中，神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）的增殖與分化起著至關重要的作用［2］。已有研究證實，異氟烷導致NSCs細胞內(nèi)鈣超載，影響NSCs的增殖與分化，可能是導致嬰幼兒學習記憶功能障礙的重要原因［3］。Calpain是細胞內(nèi)普遍存在的一類Ca2＋依賴的半胱氨酸蛋白酶，可通過調(diào)節(jié)NSCs自我更新及分化能力［4］，在神經(jīng)退行性疾病病理生理過程及學習記憶功能形成中發(fā)揮重要作用。因此本研究旨在探討異氟烷影響NSCs增殖與分化是否與Calpain信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SD大鼠由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供。DMEM／F12（1∶1）、成纖維細胞生長因子（bFGF）、表皮細胞生長因子（EGF）、B27、Accutase、層粘連蛋白購自Gibco公司，多聚鳥氨酸、Calpeptin、BrdU購自Sigma公司，抗BrdU抗體購自Cell Signaling Technology公司，抗巢蛋白（nestin）抗體、抗神經(jīng)Ⅲβ-微管蛋白（Tuj-1）抗體購自Abcam公司，抗神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體購自Invitrogen公司，抗αⅡ-spectrin抗體購自上海Abclonal公司，抗β-actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，異氟烷購自Baxter公司。

1.2 NSCs分離及培養(yǎng)

參照文獻［5］方法，75%乙醇消毒新生SD大鼠（出生1d內(nèi)）后，取其海馬組織，放入DMEM／F12（1∶1），仔細剝離海馬組織，剪碎，用1mL槍頭吹打成細胞懸液，400目濾網(wǎng)過濾，1 000r／min離心5 min，加入增殖培養(yǎng)液［DMEM／F12（1∶1）、2%B27、20ng／mL bFGF、20ng／mL EGF］重懸細胞，錐蟲藍染色，細胞計數(shù)，調(diào)整密度為5×105／mL，轉入25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。觀察神經(jīng)球形成大小，當NSCs形成的神經(jīng)球直徑達100μm時，輕輕振蕩培養(yǎng)瓶，收集神經(jīng)球至離心管，1 000r／min離心5min。棄去培養(yǎng)液，加入Accutase消化液，輕輕吹打均勻，37℃孵育5min，用1mL槍頭反復輕輕吹打至單細胞懸液，加入新鮮培養(yǎng)液，1 000r／min離心5min。錐蟲藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×104／mL進行傳代培養(yǎng)。后續(xù)實驗均使用第2代NSCs。

1.3 NSCs誘導分化培養(yǎng)

用10μg／mL多聚鳥氨酸和10μg／mL層粘連蛋白相繼包被24孔板或6孔板。將NSCs接種至培養(yǎng)板，加入NSCs分化培養(yǎng)液［DMEM／F12（1∶1）、2%B27、1%FBS、1%青鏈霉素］，約7～9d完成分化培養(yǎng)，收集并裂解細胞提取總蛋白，用Western blot檢測神經(jīng)元標志物Tuj-1和膠質(zhì)細胞標志物GFAP蛋白，鑒定分化細胞。

1.4 實驗分組及藥物處理

實驗隨機分為4組（n＝5），包括對照組（CON）、異氟烷組（ISO）、Calpeptin組（CP）、異氟烷＋Calpeptin組（ISO＋CP）。CON組:用含有21% O2和5%CO2的混合氣體處理6h；ISO組:用3.4%異氟烷處理6h；CP組:于麻醉前30min向培養(yǎng)液中加入10μmol／L Calpeptin，用含有21%O2和5% CO2的混合氣體處理6h；ISO＋CP組:于麻醉前30min向培養(yǎng)液中加入10μmol／L Calpeptin，用3.4%異氟烷處理6h。藥物干預完成后，立即更換新鮮增殖培養(yǎng)液。

1.5 NSCs增殖能力檢測

5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）在DNA合成期可代替胸腺嘧啶合成DNA，而后利用抗BrdU單克隆抗體進行免疫熒光染色，可顯示增殖細胞。將神經(jīng)球消化為單個NSCs懸液后，接種至包被過的含蓋玻片的24孔板，待NSCs完全貼壁后，于麻醉開始前30min，各組細胞培養(yǎng)液中摻入10μmol／L BrdU。待異氟烷麻醉完成后，立即更換新鮮增殖培養(yǎng)液。每個樣本隨機觀察5個視野。記錄BrdU＋細胞數(shù)和細胞總數(shù)（DAPI＋），以BrdU＋細胞數(shù)／細胞總數(shù)（DAPI＋）反映NSCs增殖能力。

1.6 免疫熒光化學檢測

取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定20min，PBS洗3×5min，封閉液（10%山羊血清＋0.3%Triton-100）室溫封閉1h，加入一抗（抗BrdU，抗nestin），4℃過夜。次日，棄一抗，PBS漂洗3×5min，加FITC標記的熒光二抗，室溫孵育2h，加DAPI染色5min，（PBS＋0.1%Twen-20）洗3×10min。50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測

各組在實驗藥物干預完成后，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離并檢測GFAP、Tuj-1、αⅡ-spectrin及裂解片段SBDP145蛋白水平。采用Image Lab 3.0軟件進行灰度分析。以GFAP、Tuj-1、αⅡ-spectrin、SBDP145與β-actin灰度值的比值反映其表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

計量資料以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原代NSCs培養(yǎng)及鑒定

取新生SD大鼠（出生1d內(nèi)）海馬組織，分離培養(yǎng)NSCs。NSCs呈懸浮生長，約3d左右形成神經(jīng)球，傳代后行免疫熒光化學染色檢測NSCs標志物nestin，紅色為陽性，第2代NSCs陽性率為（94.24 ±3.99）%。見圖1。

圖1 懸浮生長的NSCs球（A，×100）及NSCs標志物nestin染色（B，×200）Fig.1 NSCs in suspension（A，×100）and staining of NSCs marker nestin（B，×200）

2.2 異氟烷抑制NSCs的增殖

行免疫熒光化學染色檢測BrdU，結果發(fā)現(xiàn)ISO組BrdU標記的NSCs的數(shù)目相對于CON組明顯減少，并且持續(xù)至24h（P＜0.05），如圖2所示。

2.3 異氟烷上調(diào)NSCs內(nèi)Calpain的活性

圖2 異氟烷抑制NSCs的增殖并具時間依賴性Fig.2 Time-dependent inhibition of isoflurane on NSCs proliferation

收集各組NSCs裂解提取總蛋白后行Western blot檢測αⅡ-spectrin及其裂解物145kD片段（SBDP145）蛋白水平。αⅡ-spectrin是普遍存在的細胞骨架蛋白，被Calpain特異裂解為150／145kD片段，150kD隨后又繼續(xù)被Calpain裂解為145kD片段，SBDP145水平的高低用來反映Calpain的活性強度［6］。與CON組相比，ISO組在干預后0h和12h，SBDP145水平明顯升高（P＜0.01），24h時無明顯改變（P＞0.05），表明異氟烷作用于NSCs后，其胞內(nèi)Calpain活性明顯增強并且持續(xù)至少12h。見圖3。

2.4 Calpeptin減弱異氟烷致Calpain活性增強的作用

Calpeptin（CP）是Calpain的有效抑制劑，可抑制Calpain活性［7］。與CON組相比，CP組SBPD145水平降低（P＜0.01）；與ISO組相比，ISO＋CP組SBDP145水平明顯下降（P＜0.01）。見圖4。

圖3 異氟烷干預后增強Calpian活性。Fig.3 Increased calpain activities after intervention with isoflurane

圖4 Calpeptin減弱異氟烷致Calpain活性增強的作用Fig.4 Calpeptin inhibited isoflurane-induced enhanced activities of Calpain

2.5 Calpeptin可減弱異氟烷抑制NSCs增殖的作用

摻入Calpeptin后，再檢測NSCs增殖發(fā)現(xiàn):與CON組相比，ISO組BrdU＋細胞數(shù)目顯著減少（P＜0.01），而CP組無明顯差異；與ISO組相比，ISO＋CP組BrdU＋細胞數(shù)目增加（P＜0.05）。見圖5。

2.6 異氟烷促進NSCs向膠質(zhì)細胞分化

待NSCs分化完成后，檢測膠質(zhì)細胞標志物GFAP和神經(jīng)元標志物Tuj-1的表達變化。與CON組相比，ISO組GFAP水平升高（P＜0.05），Tuj-1水平無明顯改變（P＞0.05）；CP組GFAP水平無明顯改變（P＞0.05），而Tuj-1水平升高（P＜0.05）。與ISO組相比，ISO＋CP組GFAP水平降低（P＜0.01），Tuj-1水平無明顯改變（P＞0.05）。見圖6。

圖5 Calpeptin減弱異氟烷抑制NSCs增殖的作用Fig.5 Calpeptin attenuated the antiproliferative effects of isoflurane

圖6 異氟烷促進NSCs向膠質(zhì)細胞分化Fig.6 Isoflurane significantly promoted the differentiation of NSCs to gliacytes

3 討論

NSCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新和分化能力的細胞，可最終分化形成星形膠質(zhì)細胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元［2］。NSCs在大腦的發(fā)育和學習記憶功能等生理過程中發(fā)揮著至關重要的作用。麻醉藥物引起的認知功能障礙和行為改變可能是通過影響NSCs功能或形態(tài)而實現(xiàn)的。而目前體內(nèi)外實驗研究證實異氟烷可抑制NSCs的自我更新能力，改變NSCs的分化潛能［8］。參照文獻［9-10］，本研究選用3.4%異氟烷處理NSCs 6h，探討Calpain在異氟烷對NSCs增殖與分化影響中的作用。

我們研究發(fā)現(xiàn)3.4%異氟烷作用于NSCs 6h后，BrdU＋細胞數(shù)目減少，并持續(xù)24h之久，表明異氟烷可有效抑制NSCs的增殖能力，這與先前研究結果一致。與此同時，我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，異氟烷處理可顯著升高NSCs中Calpain的活性且持續(xù)12 h。而Calpain抑制劑Calpeptin不僅可拮抗異氟烷所致的Calpain活性增強，亦可顯著減弱異氟烷所致的增殖功能抑制。這就說明異氟烷可能通過增加NSCs中Calpain的活性導致NSCs增殖功能抑制。

誘導NSCs分化完成后，我們發(fā)現(xiàn)異氟烷可顯著增加GFAP的表達，而不影響Tuj-1的表達，說明異氟烷可促進NSCs更多地向星形膠質(zhì)細胞分化。而Calpeptin可顯著拮抗異氟烷所致星形膠質(zhì)細胞分化增加，說明異氟烷可能通過增加NSCs中Calpain的活性導致了NSCs更多地向星形膠質(zhì)細胞分化。

研究表明，成年大鼠學習記憶能力與海馬NSCs數(shù)量和功能密切相關［11］。而發(fā)育期NSCs自我更新能力下降或過度的分化均能導致成年海馬NSCs數(shù)量減少［12－13］。本研究與前期研究結果一致，表明了異氟烷可通過誘導發(fā)育期海馬NSCs增殖能力減弱和分化增加，最終導致海馬NSCs數(shù)量減少。而Calpain可通過調(diào)節(jié)NSCs細胞周期［4］，發(fā)揮抑制NSCs增殖和促進分化的作用。本實驗結果表明，異氟烷可能通過誘發(fā)細胞內(nèi)鈣超載，激活細胞內(nèi)的Calpain相關信號通路，從而抑制NSCs增殖和促進分化。抑制Calpain信號通路可能是保護異氟烷致發(fā)育期NSCs毒性的重要手段。

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（2015-01-16 收稿）

Isoflurane Affects Proliferation and Differentiation of Neural Stem Cells by Activating Calpain

Zhang Jianfang，Chen Xin，Wang Wei et al
Department of Anesthesiology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the mechanism by which isoflurane（ISO）affects the proliferation and differentiation of neural stem cells（NSCs）.Methods NSCs were isolated from neonatal Sprague Dawley rats（postnatal day 1）and cultured.NSCs of passage 2were used and divided into 4groups（n＝5）:control group，in which NSCs were treated with 5%CO2and 21%O2for 6h；ISO group，in which 3.4%ISO was given for intervention for 6h；calpeptin（CP）group，in which NSCs were treated with 10μmol／L CP and 5%CO2，21%O2for 6h；ISO＋CP group，in which 10μmol／L CP and 3.4%ISO were given for 6h.The proliferation of NSCs was detected by using 5-bromodeoxyuridine（BrdU）.The expression levels of GFAP，Tuj-1，αⅡ-spectrin and SBDP145were determined by Western blot.Results The number of BrdU＋cells was significantly decreased at 0，12，24h in ISO group when compared with control group，suggesting that ISO can inhibit the proliferation of NSCs.The expression of SBDP145was conspicuously upregulated in ISO group，indicating that ISO can increase the activity of calpain.After treatment with CP，the expression of SBDP145was markedly decreased in ISO＋CP group when compared with ISO group，suggesting that CP can suppress the ISO-induced increase of calpain activity.The number of BrdU＋cells was increased in ISO＋CP group，suggesting that CP could block antiproliferative effect of ISO on NSCs.The expression levels of GFAP were significantly increased in ISO group when compared with control group and there was no significant difference in Tuj-1expression between the two groups.Be contrast，cells in CP group experienced no significant change of GFAP but significant upregulation of Tuj-1.The expression level of GFAP was reduced while Tuj-1had no significant change in ISO＋CP group when compared with ISO group，which suggested that ISO can promote the differentiation of NSCs to gliocytes and such ISO-induced effect could be blocked by CP.Conclusion ISO inhibits the self-renewal capacity of NSCs and promotes the differentiation of NSCs to gliocytes by activating calpain signaling pathways.

calpain； isoflurane； neural stem cells； proliferation； differentiation

R329.54

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.004

＊國家自然科學基金資助項目（No.81200880）

張建芳，女，1987年生，碩士研究生，E-mail:zhangjianfang815＠126.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail:biyun.zz＠gmail.com