吳酬飛，謝運(yùn)昌，王 芬

(1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000;2.中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州 510275)

水體中的氨氮(NH4—N)污染日趨嚴(yán)重，造成水中魚蝦的中毒死亡［1］.高含量NH4—N經(jīng)微生物作用后可轉(zhuǎn)變成硝氮(NO3—N)，而NO3—N又極易被還原成NH4—N或亞硝氮(NO2—N)，從而造成水體富營養(yǎng)化，進(jìn)而使水中藻類及其他浮游生物大量繁殖，嚴(yán)重時(shí)會使水中溶解氧下降并釋放毒素，造成水生生物中毒或者缺氧死亡，從而影響污染水體的生態(tài)平衡，使生物多樣性遭到破壞［2－3］.人們運(yùn)用物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)技術(shù)進(jìn)行海水養(yǎng)殖廢水的修復(fù)治理，但是由于物理與化學(xué)方法具有能源消耗大、工藝難控制、容易引發(fā)二次污染等不利因素，進(jìn)而效果不盡如人意［4］.在這一形勢下，發(fā)展有效的修復(fù)方法降低水中的NH4—N含量顯得尤為重要.

生物修復(fù)通過細(xì)菌、真菌甚至高等植物以及細(xì)胞游離酶的自然代謝過程降解、去除環(huán)境中的污染物，具有著低耗、高效和環(huán)境安全等優(yōu)勢［5－7］.廣義來講，生物修復(fù)主要有微生物修復(fù)、植物修復(fù)和細(xì)胞游離酶生物修復(fù)等.目前，生物修復(fù)已成為一個(gè)富有挑戰(zhàn)性的前沿領(lǐng)域，并且研究已進(jìn)入一個(gè)相當(dāng)活躍的時(shí)期.學(xué)者們比較傾向于采用生物修復(fù)中的微生物修復(fù).而微生物修復(fù)技術(shù)，是利用天然存在的或經(jīng)培養(yǎng)所得的功能微生物群，因?yàn)榫邆淠撤N生物特性，因此在適宜環(huán)境條件下，可促進(jìn)或強(qiáng)化微生物代謝功能，同時(shí)還能降低有毒污染物活性或降解成無毒物質(zhì)［8－9］.

本研究從高密度養(yǎng)殖水體中篩選NH4-N降解微生物，對其進(jìn)行分子鑒定和降解途徑初步分析.在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將微生物接種至高氨氮污水，進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用研究，為NH4-N污水的微生物處置技術(shù)開發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 NH4—N降解菌的富集培養(yǎng)

取高密度養(yǎng)殖水體50 g，接入裝有100 mL富集培養(yǎng)基［葡萄糖 5.0 g，(NH4)2SO42.0 g，NaCl 2.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41.0 g，pH 值7.2 ～7.4，MgSO4·7H2O 0.5 g，水 1000 mL］的500 mL三角瓶中，于120 rpm，28℃下?lián)u床培養(yǎng)7 d，且每隔1 d向培養(yǎng)基中加入5%的(NH4)2SO4溶液1 mL，以淘汰不能利用NH+4的微生物.隨后，從第一次富集培養(yǎng)基中取出1 mL上清菌液，加到新鮮富集培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二輪富集培養(yǎng).

1.2 NH4—N降解菌的分離培養(yǎng)

取富集培養(yǎng)基中的上清菌液1 mL，采用十倍稀釋法用無菌水將菌液分別稀釋成 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9倍原菌液濃度，吸取稀釋菌液1 mL，在分離培養(yǎng)基［葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.0 g，NaCl 2.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41.0 g，pH 值 7.2 ～7.4，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1000 mL，2% 瓊脂］上涂布平板，置 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察NH4—N降解菌的生長情況.挑取平板上長出的單菌落進(jìn)行重復(fù)分離純化培養(yǎng)，直到得到單菌株的純培養(yǎng).

1.3 NH4—N 含量的測定

目前，針對NH4—N含量測定，已有多種成熟有效的方法.但是，考慮到減少環(huán)境污染和降低成本，因此排除了《納氏試劑分光光度法》(HJ 535－2009)與《蒸餾－中和滴定法》(HJ 537－2009)，采用了同樣方法成熟的國標(biāo)法《水楊酸分光光度法》(HJ 536－2009).水楊酸分光光度法是一種測量飲用水、大部分原水和廢水中銨的方法.其原理是:在亞硝基鐵氰化鈉［Na2Fe(CN)5NO·2H2O］存在下，銨與水楊酸［C6H4(OH)COOH］和次氯酸鈉(NaClO)反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在697 nm處用分光光度法加以測定.同時(shí)，在pH值為11.7且有亞硝基五氰絡(luò)鐵酸鈉存在時(shí)，銨與水楊酸也要發(fā)生反應(yīng)，從而樣品中所有的銨都定量地被測定.加酒石酸鉀鈉可掩蔽陽離子，特別是鈣鎂離子的干擾.這種方法的最低檢出濃度為0.01 mg/L，NH4—N檢測上限濃度可達(dá)1 mg/L.

1.4 NO3—N及NO2—N含量的測定

為了了解細(xì)菌是否將NH4—N轉(zhuǎn)化為NO3—N或NO2—N，作者又將氨氮降解菌接種至相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng).

NO3—N含量的測定，采用的是國標(biāo)法《水質(zhì)硝酸鹽氮的測定 紫外分光光度法》(HJ/T 346－2007)測定NO3—N，該方法利用硝酸根離子(NO－3)在220 nm波長處的吸收而定量測定NO3—N.溶解的有機(jī)物在220 nm處也會有吸收，而NO－3在275 nm處沒有吸收.因此，在275 nm處作另一次測量，以校正NO3—N值.

NO2—N含量的測定，采用的是經(jīng)典國標(biāo)法《水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測定分光光度法》(GB 7493－87)測定NO2—N.該方法的原理是，在磷酸介質(zhì)中，pH值為1.8時(shí)，試樣中的亞硝酸根離子(NO－2)與4－氨基苯磺酰胺(C6H8N2O2S)反應(yīng)生成重氮鹽，它再與 N—1—萘基—乙二胺二鹽酸鹽(C12H14N2·2HCl)偶聯(lián)生成紅色染料，在540 nm波長處測定吸光度.

1.5 細(xì)菌基因組DNA提取和純化

從平板培養(yǎng)基的菌落中刮取少許樣品，并加入3 mL PBS緩沖液;經(jīng)3次潤洗后，將樣品轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中;于4℃下13000 g離心5 min后，棄上清;加入500 mg玻璃珠和1 mL Buffer SLX Mlus，渦旋10 min，使細(xì)胞充分裂解.按美國Omega公司提供的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行提取和純化.

1.6 16S rDNA PCR 擴(kuò)增

以提取的DNA為模板，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn).PCR 反應(yīng)體系(50 μL):1 μL DNA 模板，1 μL dNTP，2 μL 引 物 1(27f)，2 μL 引 物 2(1492r)，1 μL Super Taq DNA 酶(2.5 U/μL)，5 μL 10 × HG PCR buffer，38 μL ddH2O.PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性，5 min，1 個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，55℃梯度溫度退火30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min.

1.7 測序鑒定

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切割獲得目標(biāo)DNA片段，送往上海生工測序，并進(jìn)行NCBI網(wǎng)上比對分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 NH4—N降解菌的分離

通過14 d的富集培養(yǎng)，1 d的分離培養(yǎng)，在高密度養(yǎng)殖廢水中篩選出3株NH4—N降解菌，命名為GYW1，GYW2和GYW3.三種微生物菌株形態(tài)(見圖1).

圖1 GYW1，GYW2和 GYW3三種NH4—N降解菌的平板和搖瓶培養(yǎng)

2.2 NH4—N降解菌的分子鑒定

以提取的三種細(xì)菌基因組DNA為模板，分別進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，結(jié)果(見圖2)，從各菌株基因組DNA中均能擴(kuò)出一條約1400 bp片段，與設(shè)計(jì)擴(kuò)增的序列長度一致.

將測序所得到的16S rDNA的序列與NCBI數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)對比.比對結(jié)果列于表1.從表1看出，GYW1序列與伯克霍德菌(Burkholderia cepacia)16S rDNA序列的相似度為99%，因而鑒定為伯克霍德菌;GYW2和GYW3與阪崎腸桿菌(Cronobacter sakazakii/Enterobacter Sakazakii)16S rDNA序列的相似度均為99%，因而鑒定為阪崎腸桿菌.

圖2 三種細(xì)菌的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

表1 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳獲得的16S rDNA序列

2.3 NH4—N降解途徑分析

對不同NH4—N降解時(shí)間的培養(yǎng)液中的NO3—N和NO2—N濃度進(jìn)行測定分析，結(jié)果見表2.由表可見，隨著時(shí)間的延長，三種微生物的NH4—N降解液中NO3—N和NO2—N含量均有所升高，且同一時(shí)間，相同的降解液中NO2—N遠(yuǎn)高于NO3—N的濃度，表明三種微生物均先將 NH4—N轉(zhuǎn)化為NO2—N，再進(jìn)一步氧化為 NO3—N.GYW1、GYW2和GYW3三種微生物的16 h NO2—N的濃度分別為:0.3079 mg/L、13.4027 mg/L 和7.0783 mg/L;NO3—N生成量的濃度僅分別為:0.0178 mg/L、1.1596 mg/L和 0.4391 mg/L;同時(shí)在 16 h時(shí)，GYW1、GYW2和 GYW3三種微生物消耗 NH4—N的濃度分別是:46.718 mg/L、38.803 mg/L 和35.556 mg/L.由此得出，在 NH4—N 降解 16 h時(shí)，GYW1將NH4—N轉(zhuǎn)化為NO2—N和NO3—N的轉(zhuǎn)化率分別為0.66%和0.04%，表明 GYW1可在新陳代謝中將NH4—N直接轉(zhuǎn)化為促進(jìn)其生長的蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)，僅產(chǎn)生極其微量的NO2—N和NO3—N，并不會對環(huán)境造成二次污染.GYW2的NO2—N和NO3—N的轉(zhuǎn)化率分別為34.54%和2.98%，GYW3的NO2—N和NO3—N的轉(zhuǎn)化率分別為19.91%和1.23%，表明GYW2和GYW3在NH4—N降解過程中，會通過新陳代謝作用生成可致癌的NO2—N 和 NO3—N，且 NO3—N 的生成滯后于NO2—N.因此，GYW2和 GYW3雖具有較強(qiáng)的NH4—N降解能力，但并不適合NH4—N廢水的實(shí)際修復(fù)應(yīng)用.

表2 NH4—N降解過程中生成NO3—N和NO2—N的含量

2.4 實(shí)際應(yīng)用研究

將菌液OD值均為0.1的GYW1接種到NH4—N初始濃度為1250 mg/L的污水中，通過觀察生長曲線發(fā)現(xiàn)，GYW1的適應(yīng)期為4 h左右，16 h時(shí)達(dá)到生長穩(wěn)定期，且該菌生長速度較快(見圖3).在NH4—N降解能力方面，該菌能在48 h內(nèi)將初培養(yǎng)基中始濃度為 1250 mg/L的 NH4—N降低至126.09 mg/L，降解率高達(dá) 89.91%(見圖 4)，意味著該菌在高氨氮污水生物修復(fù)具有較大的應(yīng)用潛力.

圖3 GYW1生長曲線圖

圖4 GYW1的NH4—N降解曲線圖

3 結(jié)論與討論

綜合以上研究，GYW1、GYW2和GYW3在不同濃度NH4—N培養(yǎng)基中，均表現(xiàn)出具有很強(qiáng)的生長能力與NH4—N降解能力.GYW1經(jīng)16S rDNA鑒定為伯克霍德菌;GYW2和GYW3為阪崎腸桿菌.

伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性細(xì)菌.美國的植物病理學(xué)家Burkholder首次發(fā)現(xiàn)它可以引起洋蔥莖腐爛，稱為洋蔥假單胞菌［10－12］.Yabuuchi et al.［13］正式將該菌及其它 6 個(gè)屬于rRNA群的假單胞菌歸為一個(gè)新屬，即伯克霍爾德菌屬.伯克霍爾德氏菌是由一些在16S rDNA序列相似度大于97.5%的種所構(gòu)成的群體.目前發(fā)現(xiàn)的伯克霍爾德氏菌有17種，分別是:洋蔥伯克霍爾德氏菌(B.Cepacia)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(B.multivorans)、椰毒伯克霍爾德氏菌(B.Cenocepacia)、越南伯克霍爾德氏菌(B.vietnamiensis)、吡咯伯克霍爾德氏菌(B.Pyrrocinia)、B.stabilis、B.dolosa、B.ambifaria、B.anthina、B.ubomensis、B.latens、B.diffusa、B.arboris、B.seminalis、B.metallica、B.contaminans和 B.lata［14－15］.這類菌對營養(yǎng)要求不高，可利用95～105種不同有機(jī)物作為碳源，大多數(shù)的培養(yǎng)環(huán)境下均可生長.伯克霍爾德氏菌具有生物防治、促進(jìn)植物生長以及生物修復(fù)等功能.它可以產(chǎn)生多種具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物，如鐵載體、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、單萜生物堿等［16－18］.在20世紀(jì)80年代，BCC曾作為生物殺蟲劑和生物殺菌劑在國外廣泛使用，如 Type wisconsin、Deny、Blue circle等.目前，國內(nèi)外已將其已應(yīng)用于生物防治，分解有毒物質(zhì)等領(lǐng)域.而此次試驗(yàn)，首次發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德菌中的某些細(xì)菌(比如GYW1)還具有較強(qiáng)的NH4—N降解能力.

阪崎腸桿菌(Enterobacter Sakazakii)是腸桿菌科的一種.阪崎腸桿菌能引起新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎以及茵血癥等［19］.目前，尚沒有其生物修復(fù)相關(guān)報(bào)道，而本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌的某些細(xì)菌具有NH4—N降解能力.

然而，GYW2和 GYW3在降解 NH4—N的同時(shí)，其代謝過程會生成NO2—N和NO3—N，產(chǎn)生二次污染，可見這兩種細(xì)菌并不適合NH4—N廢水的實(shí)際修復(fù)應(yīng)用.GYW1在降解NH4—N的同時(shí)，僅代謝產(chǎn)生極微量的NO2—N和NO3—N，分析其原因可能是在代謝途中細(xì)菌將NH4—N直接轉(zhuǎn)化為生長所需的蛋白質(zhì)、酶等營養(yǎng)物質(zhì).因此在有氧條件下，GYW1降解NH4—N作用并不會帶來二次污染，且該菌能在48 h內(nèi)將初培養(yǎng)基中始濃度為1250 mg/L的NH4—N降低至126.09 mg/L，降解率高達(dá)89.91%，可見該菌在高氨氮污水生物修復(fù)具有較大的應(yīng)用潛力.

［1］黃 婧，吳若菁，陳 彪，等.畜禽養(yǎng)殖污水中高效氨氮降解菌的篩選、鑒定及生長條件研究［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2011，5(8):1779－1784.

［2］JING S R，LIN Y F.Seasonal effect on ammonia nitrogen removal by constructed wetlands treating polluted river water in southern Taiwan［J］.Environmental Pollution，2004，127(2):291 －301.

［3］PENG Y，HE G J，JIANG W.Eco-environment quality evaluation of rare earth ore mining area based on remote sensing techniques［M］.Geo-Informatics in Resource Management and Sustainable Ecosystem.Springer Berlin Heidelberg，2013:246 －257.

［4］周 鑫，王素英，池凌鈺，等.海水養(yǎng)殖廢水氨氮降解菌的篩選及培養(yǎng)條件研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(11):4908－4910.

［5］YANG S，YANG F.Nitrogen removal via short-cut simultaneous nitrification and denitrification in an intermittently aerated moving bed membrane bioreactor［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，195:318 －323.

［6］COREY P，KIM J K，DUSTON J，et al.Bioremediation potential of Palmaria palmata and Chondrus crispus(Basin Head):effect of nitrate and ammonium ratio as nitrogen source on nutrient removal［J］.Journal of Applied Phycology，2013，25(5):1349 －1358.

［7］Cycoń M，Z·mijowska A，Wójcik M，et al.Biodegradation and bioremediation potential of diazinon-degrading Serratia marcescens to remove other organophosphorus pesticides from soils［J］.Journal of Environmental Management，2013，117:7 －16.

［8］DONG Y，ZHANG Z，JIN Y，et al.Nitrification performance of nitrifying bacteria immobilized in waterborne polyurethane at low ammonia nitrogen concentrations［J］.Journal of Environmental Sciences，2011，23(3):366 －371.

［9］NISHIMURA F，HIDAKA T，NAKAGAWA A，et al.Removal of high concentration ammonia from wastewater by a combination of partial nitrification and anammox treatment［J］.Environmental Technology，2012，33(13):1485 －1489.

［10］VU H P，MU A，MOREAU J W.Biodegradation of thiocyanate by a novel strain of Burkholderia phytofirmans from soil contaminated by gold mine tailings［J］.Letters in Applied Microbiology，2013，57(4):368 －372.

［11］CHUEIRE O，TIEDJE J M，ORME N～O-ORRILLO E E，et al.Genome sequences of Burkholderia sp.［J］.Journal of Bacteriology，2012，194(24):6927.

［12］AJAO A T，YAKUBU S E，UMOH V J，et al.Bioremediation of refinery wastewater using immobilised Burkholderia cepacia and Corynebacterium sp.and their transconjugants［J］.Journal of Xenobiotics，2013，3(1):19 －23.

［13］JIX，RIPP S A，LAYTON A C，et al.Assessing long term effects of bioremediation:soil bacterial communities 14 years after polycyclic aromatic hydrocarbon contamination and introduction of a genetically engineered microorganism［J］.Journal of Bioremediation ＆ Biodegradation，2013.

［14］SHIBATA T F，MAEDA T，NIKOH N，et al.Complete genome sequence of Burkholderia sp.strain RPE64，bacterial symbiont of the bean bug Riptortus pedestris［J］.Genome Announcements，2013，1(4):e00441 －13.

［15］SUáREZ-MORENO Z R，CABALLERO-MELLADO J，COUTINHO B G，et al.Common features of environmental and potentially beneficial plant-associated Burkholderia［J］.Microbial Ecology，2012，63(2):249 －266.

［16］GASSER I，CARDINALE M，MüLLER H，et al.Analysis of the endophytic lifestyle and plant growth promotion of Burkholderia terricola ZR2-12［J］.Plant and Soil，2011，347(1 － 2):125 －136.

［17］LIAO Y，MIN X，YANG Z，et al.Physicochemical and biological quality of soil in hexavalent chromium-contaminated soils as affected by chemical and microbial remediation［J］.Environmental Science and Pollution Research，2014，21(1):379 －388.

［18］MITTER B，PETRIC A，SG CHAIN P，et al.Genome analysis，ecology，and plant growth promotion of the endophyte Burkholderia phytofirmans strain PsJN［J］.Molecular Microbial Ecology of the Rhizosphere:2013(1－2):865－874.

［19］張雪梅，孫鑫貴，盧 陽，等.阪崎腸桿菌的研究進(jìn)展［J］.中國乳品工業(yè)，2008，36(3):42 －46.