郭旭東，李相冬，呂曉亮，趙 平，姜彥陽(yáng)，孟繁波＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130033；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院；4.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院）

基因芯片分析急性心肌梗死患者外周血差異基因表達(dá)譜

郭旭東1，李相冬1，呂曉亮2，趙 平3，姜彥陽(yáng)4，孟繁波1＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130033；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院；4.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院）

冠狀動(dòng)脈疾病、心肌梗死是由多種遺傳和環(huán)境因素，以及它們之間的相互作用引起的［1］。2007年的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWA）揭示了遺傳與急性心肌梗死的關(guān)系。目前已經(jīng)有11個(gè)染色體片段（chromosome segments）確定與心肌梗死相關(guān)。有研究表明染色體9p21與冠心病相關(guān)性最強(qiáng)［2，3］。這些異?；?qū)?lái)可能作為急性心肌梗死診斷及治療的新靶點(diǎn)。當(dāng)前的熱點(diǎn)基因PSCK9被證實(shí)與脂代謝相關(guān)，人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)PCSK9可以影響低密度脂蛋白膽固醇的水平。而抑制PCSK9的表達(dá)作為一種有效的降脂治療新方法，已證明可以降低血脂并提高他汀類藥物的療效［4］。本研究擬采用基因芯片方法尋找與急性心肌梗死相關(guān)的差異基因，發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死診斷的基因標(biāo)記，并探索能用于急性心肌梗死治療的靶基因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2012.06－2014.08在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院住院治療的12例急性心肌梗死患者為研究對(duì)象，其中男9例，女3例。另外選擇12例健康人設(shè)為對(duì)照組。3例急性心肌梗死組患者與3例健康對(duì)照組患者外周血RNA進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。9例急性心肌梗死組與9例健康對(duì)照組進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。兩組臨床資料進(jìn)行比較，相關(guān)結(jié)果顯示，各組間性別、年齡、腎功能、血脂、血糖、高血壓、家族史、吸煙及飲酒史、他汀類藥物服用史均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn) 急性心肌梗死診斷以中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管分會(huì)2010年修訂的急性心肌梗死診斷和治療指南為標(biāo)準(zhǔn)。心臟生物標(biāo)志物增高或增高后降低，至少有1次數(shù)值超過(guò)參考值上限的第99百分位數(shù)（即正常上限），并有以下至少1項(xiàng)心肌缺血的證據(jù)：①心肌缺血臨床癥狀；②心電圖出現(xiàn)新的心肌缺血變化，即新的ST段改變或左束支傳導(dǎo)阻滯［按心電圖是否有ST段抬高，分為急性ST段抬高型心肌梗死STEMI和非STEMI］，③心電圖出現(xiàn)病理性Q波；④影像學(xué)證據(jù)顯示新的心肌活力喪失或區(qū)域性室壁運(yùn)動(dòng)異常。健康對(duì)照組為既往無(wú)心肌缺血病史，心電圖、心臟彩超、心肌酶、平板運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)正常者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 兩組入選者均排除糖尿病、肝功能不全、腎功能不全、外周動(dòng)脈疾病、腫瘤、腦卒中。

1.2 研究方法

1.2.1 基因芯片檢測(cè) 抽取急性心肌梗死組3例，健康對(duì)照組3例共6例外周血樣本2ml，加入2ml－Trizol，－80℃保存，送北京鼎國(guó)昌盛有限公司進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。本試驗(yàn)所用芯片為美國(guó)Affymetrix公司研制的人全基因組芯片，芯片表達(dá)譜構(gòu)建由北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司完成。

1.2.2 外周血RNA提取 白細(xì)胞分離抽取研究對(duì)象晨起空腹靜脈血2ml，加入EDTA抗凝管中，進(jìn)行白細(xì)胞分離。①取2ml抗凝外周血（采血時(shí)間不超過(guò)3h）②加入等體積無(wú)菌PBS于外周血中充分混合，形成細(xì)胞懸液；③加入4ml淋巴細(xì)胞分離液于另一離心管。④吸取4ml細(xì)胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細(xì)胞分離液表面（注意勿與淋巴細(xì)胞分離液混合）。離心1 500rpm 20min。⑤用吸管輕輕吸出界面層（白膜）入另一離心管中。無(wú)菌冷PBS洗2次，最后1次洗滌可以將細(xì)胞懸液移入EP管中，離心去上清，用于提取RNA。RNA提取先加1ml Trizol于EP管中，若凍存細(xì)胞直接加入Trizol，不需解凍，吹打裂解后室溫靜置5－10min。⑥加入0.2ml氯仿（三氯甲脘），劇烈震蕩15s，室溫靜置2－3min。在4℃下1，2000轉(zhuǎn)離心15min。⑦小心吸出上清水相約600μl移入另一離心管（注意不要抽到蛋白層），加入500μl異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min。⑧4℃1，2000g離心10min，棄上清液，底部可見(jiàn)白色物質(zhì)。⑨加入1ml 75%冷乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌，清洗異丙醇。⑩4℃7 500g離心5 min，去除乙醇后晾5－10min，半透明即可，以20 μlDEPC水溶解RNA。取3μlRNA樣本，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳（見(jiàn)圖1）；1μlRNA樣品于紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，以A260／280在1.8－2.0視為RNA樣本合格。不合格樣本棄去。

1.2.3 cDNA的合成 使用TOYOBO ReverTra Ace試劑盒。將RNA在65℃條件下加熱5min，立即放于冰上冷卻。配制反應(yīng)液，反應(yīng)液組成Nuclease－free Water up to 10μl，5×RT Buffer 2μl，RT Enzyme Mix 0.5μl，Primer Mix 0.5μl，RNA 0.5pg－1μg，Total volume 10μl。在37℃條件下，進(jìn)行15min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在98℃條件下，進(jìn)行5 min的酶失活反應(yīng)。保存在－20℃冰箱中。以備進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 熒光定量采用TIANGEN熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版。建立20μl體系，加入2×SuperReal PreMix Plus10μl，正向引物0.6μl，反向引物0.6μl，cDNA模板2μl，50× ROX Reference Dye△0.4μl，RNase－free ddH2O 6.4μl。使用Mx3005P設(shè)備進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：1×95℃15min，40×（95℃10sec＋62℃30sec）。隨機(jī)選取上調(diào)基因CYP4F3、下調(diào)基因USP25、表達(dá)無(wú)差異基因IL13RA1進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證。應(yīng)用GAPDH為內(nèi)參，采用2－△△Ct法進(jìn)行差異倍數(shù)計(jì)算。每組取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。PCR引物序列如下表1。

圖1 部分RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間差異采用t檢驗(yàn)；定性資料采用頻數(shù)及率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間差異采用卡方檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)；若P＜0.05，則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 熒光定量引物序列

2 結(jié)果

2.1 基因芯片結(jié)果分析 基因芯片結(jié)果按照p－value≤0.05，logFC絕對(duì)值＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，心肌梗死組與對(duì)照組檢出559個(gè)RNA片段存在差異。其中低表達(dá)基因271個(gè)，高表達(dá)基因288個(gè)（圖略）。本研究采用SAM分析軟件用于基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析。

2.2 差異基因生物信息分析 比較基因芯片結(jié)果共篩選出559個(gè)差異基因，對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO分析，這些基因歸屬于128個(gè)細(xì)胞組成，參與了521個(gè)生物過(guò)程和151個(gè)分子功能。

2.3 差異基因代謝通路分析 對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG分析559個(gè)基因共參與107個(gè)基因通路。

2.4 熒光定量PCR結(jié)果分析 本研究中目標(biāo)基因與內(nèi)參基因溶解曲線為單一峰型，未見(jiàn)其它峰型，峰型較尖銳（見(jiàn)圖2），提示各基因溶解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，未見(jiàn)非特異性雙鏈DNA產(chǎn)物及二聚體。擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，熒光吸收?qǐng)D譜的S型曲線形狀完好，符合定量要求（見(jiàn)圖3）。

圖4 CYP4F3、USP25、IL13RA1基因熒光定量相對(duì)表達(dá)差異

熒光定量PCR結(jié)果：急性心肌梗死組外周血基因CYP4F3表達(dá)高于對(duì)照組P＝0.006；急性心肌梗死組外周血基因USP25表達(dá)低于對(duì)照組P＝0.003；急性心肌梗死組IL13RA1表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異P＝0.681（見(jiàn)表2），與基因芯片結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致（見(jiàn)圖4）。說(shuō)明基因芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 熒光定量PCR基因表達(dá)差異分析

3 討論

在過(guò)去十幾年中，已確定急性心肌梗死發(fā)病與數(shù)個(gè)基因變異相關(guān)，這些基因變異涉及凝血蛋白，纖溶系統(tǒng)，血小板受體，高半胱氨酸代謝，血管內(nèi)皮功能障礙，異常血流和氧化應(yīng)激等［5］。而近幾年的研究表明，伴有冠狀動(dòng)脈鈣化、擴(kuò)張和主干狹窄的冠心病比其他情況更多地受到遺傳因素的影響［3］。有報(bào)道外周血相關(guān)的基因的多態(tài)性檢測(cè)能夠比較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生幾率［6］。本研究通過(guò)分析急性心肌梗死病人外周血基因RNA的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了急性心肌梗死病人中有559個(gè)表達(dá)差異基因，其中288個(gè)基因高表達(dá)，271個(gè)基因低表達(dá)。

對(duì)這些差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，559個(gè)差異基因共參與了107條基因通路，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer＇s disease）、上皮細(xì)胞信號(hào)在幽門螺桿菌感染（Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection）、受體相互作用（Cytokine－cytokine receptor interaction）、細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、胰島素信號(hào)通路（Insulin signaling pathway）、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）、小細(xì)胞肺癌（Small cell lung cancer）、腎細(xì)胞癌（Renal cell carcinoma）等。

本研究中差異基因較為集中分布的通路，已有多條與冠心病、急性心肌梗死相關(guān)，其中14個(gè)差異基因參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus）途徑，4個(gè)基因參與阿爾茨海默病（Alzheimer＇s disease）代謝途徑，目前已有報(bào)道證明系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)性增加［7］，有文獻(xiàn)證明阿爾茨海默病可能有冠心病存在關(guān)聯(lián)［8］。其他通路如細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）也有與心肌梗死相關(guān)的報(bào)道。

本研究差異基因中有3個(gè)基因參與了卟啉和葉綠素代謝（Porphyrin and chlorophyll metabolismz）代謝途徑，而目前的研究尚未見(jiàn)關(guān)于卟啉和葉綠素代謝與急性心肌梗死有關(guān)的報(bào)道，該途徑與急性心肌梗死具體有何關(guān)聯(lián)尚未明確。

本研究中CYP4F3是P450大家族中的成員，屬CYP4F亞家族，P450酶系是自然界中廣譜的生物催化劑，能夠作用于多種物質(zhì)。Granville等人發(fā)現(xiàn)再灌注階段注射CYP非特異性抑制劑氯霉素、西咪替丁及CYP2C9選擇性抑制劑磺胺苯吡唑能明顯減少大鼠心臟ROS的生成，縮小心梗面積。該實(shí)驗(yàn)首次提出心臟CYP參與心肌損傷，機(jī)制可能與經(jīng)CYP途徑促活性氧自由基（Reactiveoxygenspecies，ROS）生成有關(guān)。同時(shí)，再灌注階段給藥對(duì)心肌的保護(hù)作用表明急性心肌缺血患者于缺血后采取藥物治療仍可能有效，該發(fā)現(xiàn)具有重要臨床意義［9］。

ROS是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)，是細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)信號(hào)分子。CYP4F3的代謝產(chǎn)物20－HETE是小動(dòng)脈的強(qiáng)收縮劑，能通過(guò)抑制Kca通道，激活L型Ca2＋通道，以及活化PKC等途徑，增加細(xì)胞內(nèi)鈣含量，收縮微小動(dòng)脈。損傷作用可能與阻斷心臟sarcKatp通道有關(guān)。本研究中CYP4F3在心肌梗死組表達(dá)升高，表明CYP4F3可能參與了急性心肌梗死的心肌損傷與修復(fù)過(guò)程。

USP25是USPS家族成員之一，范素蛋白酶體積系與腫瘤發(fā)生的所有進(jìn)程，其家族成員USP22、USP28均證明與腫瘤相關(guān)［10，11］。而USP25已證明參與了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，通過(guò)誘導(dǎo)miR－200C促進(jìn)部分非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［12］。還有研究證明USP25能夠負(fù)調(diào)控IL17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［13］。在本研究中USP25與健康組比較表達(dá)量降低，而急性心肌梗死與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)，但USP25如何參與急性心肌梗死的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

急性心肌梗死組與健康對(duì)照組比較共篩選出差異基因559個(gè)，其中288個(gè)基因高表達(dá)，271個(gè)基因低表達(dá)。GO分析顯示：這些基因歸屬于128個(gè)細(xì)胞組成，參與了521個(gè)生物過(guò)程和151個(gè)分子功能；KEGG分析共參與107個(gè)基因通路。對(duì)差異基因進(jìn)行基因水平驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)了基因芯片分析結(jié)果可信。

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2014－10－19）

1007－4287（2015）06－0977－04

＊通訊作者