崔 倪，李 明，倪勁松，宋 軍

（1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部病理科，吉林長春130041；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院電診科，吉林長春130033）

過表達(dá)TROP2對細(xì)胞增殖及遷移能力的影響

崔 倪1，李 明2，倪勁松2，宋 軍3＊

（1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部病理科，吉林長春130041；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院電診科，吉林長春130033）

目的 探討過表達(dá)腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2（TROP2）對細(xì)胞增殖及遷移的影響，為闡明腫瘤的發(fā)生機(jī)制提供新的途徑。方法 構(gòu)建TROP2真核表達(dá)載體pcDNA3－TROP2；采用脂質(zhì)體法將pcDNA3－TROP2轉(zhuǎn)染入人正常肝細(xì)胞LO2中，并通過G418壓力篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)TROP2的細(xì)胞株，之后通過MTT法檢測細(xì)胞的活力，通過劃痕法檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果 成功獲得了過表達(dá)TROP2的細(xì)胞株；進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，過表達(dá)TROP2可增強細(xì)胞的活力和遷移能力。結(jié)論 過表達(dá)TROP2可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，此結(jié)果為闡明腫瘤發(fā)生機(jī)制及腫瘤治療提供了新的途徑。

TROP2；腫瘤發(fā)生；增殖；遷移

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0879）

腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2（Tumor－associated calcium signal transducer2，TROP2）基因于1995年首次被克隆。該基因位于人類1號染色體短臂D1S2890和D1S2801之間一個長約2.6cm的區(qū)域上，cDNA全長972bp，編碼一個含323個氨基酸、35.7kDa的跨膜糖蛋白。此蛋白帶有四個潛在的從基因組序列中預(yù)測出的N連接糖基化位點，其疏水的氨基酸分布具有I型膜蛋白特征，如類EGF重復(fù)以及與IL－2受體的序列同源［1，2］。并且它包含一個上皮生長因子樣的重復(fù)區(qū)、一個甲狀腺球蛋白樣重復(fù)區(qū)，其分子羥基端含有潛在的絲氨酸和酪氨酸磷酸化位點和一個磷脂?；〈冀Y(jié)合共有序列［3］。TROP2在人體正常組織及體細(xì)胞成熟組織中很少表達(dá)，甚至幾乎沒有表達(dá)。但研究發(fā)現(xiàn)，TROP2在結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌以及食管鱗狀細(xì)胞癌等多種類型的人類惡性腫瘤組織中均高表達(dá)［4－8］。由此我們推測，TROP2是一種新的原癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的相關(guān)性。本論文主要通過在正常細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)TROP2來研究它在腫瘤發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人正常肝細(xì)胞L02購自上海細(xì)胞庫。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用Trizol法提取HepG2總RNA，并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后用TROP2特異性引物通過PCR方法擴(kuò)增TROP2的編碼序列，TROP2的正向引物：5’－GGAATTCATGGCTCGGGGCCCCGGCCTCGC－3’；逆向引物：5’－GCTCTAGAGGGTACCTACAAGCTCGGTTCCTTTC－3’。將PCR產(chǎn)物用EcoRI和XbaI酶切后連接入pcDNA3中，構(gòu)建pcDNA3－TROP2。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 LO2細(xì)胞分別在含10%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入青霉素（100U／ml）和鏈霉素（100U／ml），培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃。在6孔板中，每孔接種6×105個細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70－90%，以一孔細(xì)胞為例，吸凈細(xì)胞上清液，D－Hank’s清洗，換用無血清及無雙抗的DMEM培養(yǎng)液，將10μl Gene Trans滴入250μl無血清及無雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，混勻，室溫靜置5min，再將9μg質(zhì)粒滴入無血清及無雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，混勻，將質(zhì)粒－DMEM混合液逐步滴入Gene Trans－DMEM混合液中，混勻，室溫靜置20min，然后滴加在含完全培養(yǎng)基的細(xì)胞上清中，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，改用含雙抗及含10%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48h。

1.4 構(gòu)建TROP2過表達(dá)的LO2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 LO2細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24h以每孔1×106個細(xì)胞接種于6孔板，每孔2ml。轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到80%左右。按照Gene Trans說明書將pcDNA3及pcDNA3－TROP2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入LO2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，用500μg／ml濃度的G418持續(xù)篩選2周左右，挑取單克隆細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.5 Western blot 提前24h將細(xì)胞鋪于6孔板，至提蛋白時細(xì)胞處于對數(shù)生長期。PBS洗滌細(xì)胞，5 000rpm，離心5min，重復(fù)3次，每孔（6孔板）加入200μl裂解液，冰上30min，每隔5min渦旋振蕩一次，以使細(xì)胞充分裂解。12 000rpm離心10min后，將上清移入EP管，加入4×上樣buffer，煮樣10 min，使蛋白變性。取樣品上樣，電泳。配制轉(zhuǎn)膜緩沖液并于4℃預(yù)冷。將PVDF膜用甲醇浸泡40sec，取出后浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中備用。將方盤中放入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在液面下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜裝置的安裝。并將轉(zhuǎn)膜裝置放入電泳槽中，倒入轉(zhuǎn)膜緩沖液，100V轉(zhuǎn)膜2h后取出PVDF膜，將膜標(biāo)記正反面及電泳方向。用TBST（0.2%的Tween20）洗滌PVDF膜5min 2次，再用5%的脫脂奶粉4℃封閉過夜。之后用TBST（0.2%的Tween20）快速沖洗2遍，再洗滌15 min 1次，5min 4次（洗膜時均放于搖床上，以下同）。將用TBST稀釋后的一抗與PVDF膜一同裝入雜交袋中，放于搖床室溫4h。取出PVDF膜，用TBST（0.2%的Tween20）快速沖洗2遍，再洗滌15 min 1次，5min 4次。將用TBST稀釋后的二抗與PVDF膜一同裝入雜交袋中，放于搖床室溫2h。取出PVDF膜，用TBST（0.2%的Tween20）快速沖洗2遍，再洗滌15min 1次，10min 4次。將PVDF膜拿入暗室，ECL顯影。

1.6 MTT 0.25%胰酶消化各實驗組細(xì)胞后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，以每孔1×103個細(xì)胞鋪于96孔板，每孔體積200μl，每種細(xì)胞設(shè)3個平行孔，共鋪8塊板。將培養(yǎng)板移入37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，每隔24h取出1塊板，每孔加入MTT溶液（5mg／ml）20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸棄孔內(nèi)的液體，每孔加入200μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物溶解。選擇OD570，使用酶標(biāo)儀測定各孔的光吸收值。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制曲線。

1.7 細(xì)胞運動實驗 0.25%胰酶消化各實驗組細(xì)胞后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，以每孔1×106個細(xì)胞鋪于6孔板，每孔2ml，每種細(xì)胞設(shè)2個平行孔。24h后，細(xì)胞基本鋪滿整個孔，用大槍頭刮細(xì)胞表面，出現(xiàn)大約5mm寬的劃痕區(qū)。將各培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基用新鮮的無血清培養(yǎng)基替換后繼續(xù)培養(yǎng)，以防止劃落的細(xì)胞重新落入劃痕區(qū)。繼續(xù)培養(yǎng)24－48h后觀察，并每隔24h拍照一次進(jìn)行記錄。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用卡方檢驗對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P＜0.01表示統(tǒng)計學(xué)差異非常顯著。所有數(shù)據(jù)均用SPSS10.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)TROP2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立及鑒定為了研究TROP2基因的功能，本研究將pcDNA3－TROP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LO2細(xì)胞，同時以轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒的LO2細(xì)胞做對照。將兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞用G418持續(xù)篩選2周，挑取單克隆細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，從而獲得過表達(dá)TROP2的LO2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。提取胞漿蛋白，之后進(jìn)行Western blot，檢測細(xì)胞中TROP2的表達(dá)。結(jié)果顯示，在pcDNA3－TROP2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中，與pcDNA3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的LO2細(xì)胞相比，TROP2蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖1），說明已成功建立了TROP2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。

圖1 Western blot方法鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中TROP2的表達(dá)

2.2 過表達(dá)TROP2對細(xì)胞體外增殖能力的影響分別將轉(zhuǎn)染pcDNA3、pcDNA3－TROP2質(zhì)粒的LO2細(xì)胞以相同密度（1×103個／孔）鋪于96孔板，進(jìn)行MTT檢測，以分析各組細(xì)胞的體外增殖能力。實驗結(jié)果如圖2所示，從第3天開始，轉(zhuǎn)染pcDNA3－TROP2質(zhì)粒的細(xì)胞比轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒的細(xì)胞活力明顯增高（P＜0.05），提示過表達(dá)TROP2后可以顯著增強LO2細(xì)胞的體外增殖能力。

2.3 過表達(dá)TROP2對細(xì)胞運動能力的影響 以每孔1×106個細(xì)胞的密度將兩組細(xì)胞分別鋪于6孔板，24h后細(xì)胞基本鋪滿整個孔，然后用大槍頭刮細(xì)胞表面，出現(xiàn)一道約5mm的劃痕區(qū)，換成新鮮的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h及48h分別在顯微鏡下觀察劃痕區(qū)的寬度并進(jìn)行拍照記錄。實驗結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染pcDNA3－TROP2質(zhì)粒的細(xì)胞劃痕區(qū)寬度明顯比轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒的細(xì)胞變窄。這說明過表達(dá)TROP2的LO2細(xì)胞運動能力明顯增強。

圖2 過表達(dá)TROP2對細(xì)胞活力的影響

圖3 細(xì)胞劃痕試驗檢測細(xì)胞的運動能力

3 討論

惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，而惡性腫瘤難以根治的一個重要原因就在于目前針對腫瘤發(fā)生的具體機(jī)制還不是十分清楚?，F(xiàn)有研究表明，腫瘤是由多因素引起、多基因參與并經(jīng)歷了多階段的演變過程，其中原癌基因的活化在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要作用。人類滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原（TROP2）基因，即腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2，是1995年首次被克隆出來的新基因［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)，TROP2在人體正常組織及體細(xì)胞成熟組織中很少表達(dá)，甚至幾乎沒有表達(dá)，但是卻發(fā)現(xiàn)它在結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌以及食管鱗狀細(xì)胞癌等多種類型的人類惡性腫瘤中均高表達(dá)［4－8］。因此推測TROP2是一種新的原癌基因，并與多種腫瘤具有密切的相關(guān)性。但是對TROP2基因的功能和它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及如何引起腫瘤發(fā)生的機(jī)制等方面的研究還不是十分清楚。本文在正常細(xì)胞中過表達(dá)TROP2后，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞有惡性轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，表明TROP2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

為了確切研究TROP2基因的結(jié)構(gòu)與功能，以及它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本文采用了基因轉(zhuǎn)染的方法，這是目前應(yīng)用最多、技術(shù)最成熟的研究基因功能的方法之一。此方法是將目的基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞后，通過不同檢測手段及觀察該細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，從而了解該基因功能。因基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)染效率和是否持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)兩方面因素的影響，所以本文又采用了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，即將pcDNA3－TROP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LO2細(xì)胞，并以轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒和GFP質(zhì)粒的細(xì)胞做對照，然后在G418選擇壓力下持續(xù)篩選2周，從而獲得過表達(dá)TROP2的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。之后，采用Western Blot方法從蛋白質(zhì)水平來鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中TROP2的表達(dá)。

我們用MTT法分別檢測了轉(zhuǎn)染pcDNA3及pcDNA3－TROP2質(zhì)粒的LO2細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的LO2細(xì)胞的體外增殖能力，并繪制了連續(xù)8d的生長曲線，從圖14中我們可以看出過表達(dá)TROP2基因的細(xì)胞株的體外增殖能力明顯增強。說明TROP2在促細(xì)胞生長中發(fā)揮了重要作用。

正常細(xì)胞外粘著糖蛋白，可增強細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘著。而癌細(xì)胞的纖粘連蛋白顯著減少或缺失，鈣粘蛋白合成發(fā)生障礙，從而破壞了細(xì)胞與基質(zhì)之間和細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘著，所以癌細(xì)胞與其同源正常組織細(xì)胞相比，細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基底物間的粘著性明顯降低，在體內(nèi)容易分散和轉(zhuǎn)移。對此我們采用細(xì)胞劃痕試驗對過表達(dá)TROP2細(xì)胞株的運動能力進(jìn)行了分析。細(xì)胞劃痕法是借鑒體外細(xì)胞致傷愈合試驗?zāi)Ｐ?，來測定腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上的運動能力。我們研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3－TROP2質(zhì)粒的LO2細(xì)胞在24h內(nèi)與對照組細(xì)胞的運動能力相比明顯增強，說明TROP2在促細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示TROP2的過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，從而為闡明腫瘤的發(fā)生機(jī)制以及腫瘤的治療提供了新的途徑。

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Effect of overexpression of TROP2 on cell proliferation and mobility

CUI Ni1，LI Ming2，NI Jin－song2，et al.（1.College of Clinical Medicine，Jilin University，Changchun130021，China；2.Department of Pathology，the First Hospital of Jilin University，Changchun130041，China）

Objective To investigate the effect of overexpression of tumor－associated calcium signal transducer2（TROP2）on cell proliferation and mobility.Methods Construction of TROP2expression vector pcDNA3－TROP2，and transfected it into human normal liver cell L02with Gene Trans，then screening of stable expression of TROP2cells by G418.we further investigate the cell viability by using MTT mathod and cell mobility by using scratch test.Results constructed TROP2－overexpression cell line successfully，further result revealed that overexpression of TROP2enhanced cell viability and mobility.Conclusion Overexpression of TROP2can promote tumorigenesis，these results provided a new target for clarifing mechanism of tumorigenesis and tumor therapy

TROP2；tumorigenesis；proliferation；mobility

R730.231

A

2014－09－15）

1007－4287（2015）06－0879－04

＊通訊作者