鄭 妍，劉忠民，李 靜，王永良

（吉林大學體育學院，吉林長春130012）

不同負荷游泳運動對老齡大鼠學習記憶能力及海馬神經(jīng)Bcl－2、Bax的影響

鄭 妍，劉忠民＊，李 靜，王永良

（吉林大學體育學院，吉林長春130012）

隨著人們年齡的逐漸增大，大腦會在組織形態(tài)學方面有所改變，更重要的是在其神經(jīng)生化等方面也會隨著人年齡的增長而出現(xiàn)一系列的改變，這些改變會使其逐步走向衰老，這是自然界一種復雜的生命現(xiàn)象。在老齡化社會背景下，以認知機能退行為主要特征的腦老化問題十分突出，其進行性風險是老年性癡呆。海馬神經(jīng)是執(zhí)行認知機能的靶器官，是人體認知和學習記憶能力的控制中樞。人體衰老后，大腦也會逐漸老化，而此時腦海馬區(qū)也會發(fā)生相應的變化。運動干預延緩海馬神經(jīng)的認知老化是目前防治認知退行性疾病的主流研究之一。

多數(shù)研究認為，通過運動可以逆轉海馬神經(jīng)突觸數(shù)量減少［1］和突觸體膜流動性下降［2］，增加c－fos等基因的表達［3］，延緩腦老化的進程。然而運動方式干預海馬神經(jīng)認知老化的具體效果與機制研究尚屬少見，仍然有待于進一步研究，究竟何種機制占主導也尚待實驗證明。因此，還需進一步提出假說及實驗驗證，尋求改善認知機能的相關的有力依據(jù)和不利影響，從而明晰其機制，為運動干預腦老化的深入研究奠定基礎，提供科學依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實驗動物與分組

16月齡的雄性wistar大鼠48只，生產(chǎn)許可證為SCXK（吉）－2013－0001，全部由吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機平均分為對照組（無人為的運動負荷，常規(guī)飼養(yǎng)）、大負荷運動組（每天游泳60min）、中等負荷運動組（每天游泳30 min）、小負荷運動組（每天游泳15min）［35］。進行為期八周的游泳運動，在水溫30±1℃，在直徑為60cm，高80cm，水深70cm的圓形桶中進行。

1.2 八臂迷宮實驗

行為學測試采用八臂迷宮實驗，為期八周的運動干預實驗結束后，對各組大鼠進行禁食減重，減至體重的85%，讓大鼠產(chǎn)生饑餓感，這樣在行為學測試時，大鼠才有想要覓食的動力。體重達標后，進行適應性訓練，為期3天，每天1次。適應性訓練開始時在每個臂的盡頭處放置少量飼料，將老齡大鼠放置于八臂迷宮中央處，讓其自由選擇并吃食，每只大鼠適應5min后取出。

正式實驗共為期7天，隨機選擇4個臂放置食物；每只大鼠將4個臂食物吃盡后取出，即結束1次測試；如5min后臂中食物仍未吃完，則也將大鼠取出，即結束1次測試；測試期間進行全程實時監(jiān)控。測試指標為：①完成時間：老齡大鼠吃完所有食物所用時間，如果到5min后食物仍有剩余，則停止測試，按照5min記錄時間；②工作記憶錯誤：老齡大鼠每重復進入已吃過食物的臂1次則為1次工作記憶錯誤，記錄每次測試時大鼠工作記憶錯誤次數(shù)。

每次測試時的實驗條件保持一致；每只大鼠測試完畢后，用酒精認真擦洗實驗器材，避免留下殘留氣味。

1.3 實驗取材及免疫組化染色測試

行為學測試結束后，對老齡大鼠進行解剖以備進行相關指標檢測。在運動干預實驗過程中，由于高齡、溺水等原因各組大鼠均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，在行為學測試后，每組大鼠剩余數(shù)為：大負荷運動組6只，中等負荷運動組7只，小負荷運動組8只，對照組10只，因此每組隨機抽取出6只老齡大鼠進行解剖以備進行相關指標檢測。

首先給大鼠注射鹽酸利多卡因注射液（5ml／只）將大鼠麻醉，隨后將大鼠固定在手術臺上；利用手術工具打開大鼠腹腔，并暴露大鼠的心臟，然后從大鼠心臟左心室尖處依次灌注0.9%的生理鹽水和4%的多聚甲醛固定液。固定后，將大鼠斷頭并取其海馬組織浸泡在10%中性福爾馬林固定液中，石蠟包埋切片，進行免疫組化染色時嚴格按照說明書要求由專業(yè)技術人員操作。

1.4 圖像分析與數(shù)據(jù)處理方法

八臂迷宮實驗數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計，采用組間對比使用重復測量方差分析的方法，結果用平均數(shù)±標準差表示，P＜0.01表示非常顯著性差異，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＞0.05則表示沒有統(tǒng)計學差異。

免疫組化圖像分析采用正置顯微鏡，計數(shù)同一視野下陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比，數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計，采用Student’s t－test方法，結果用平均數(shù)±標準差表示，P＜0.01表示非常顯著性差異，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＞0.05則表示沒有統(tǒng)計學差異。

表1 對各組老齡大鼠運動干預后進行八臂迷宮實驗和海馬神經(jīng)Bcl－2、Bax免疫組化檢測結果

2 結果

2.1 各組老齡大鼠進行八臂迷宮實驗的結果

本實驗中，老齡大鼠每次進行八臂迷宮實驗的結果（見表1）。完成時間，與對照組相比，小負荷運動組用時最少（P＜0.05）；大負荷運動組多于對照組（P＞0.05）；工作記憶錯誤次數(shù)，與對照組相比，小負荷運動組明顯減少（P＜0.05）；大負荷運動組出現(xiàn)錯誤次數(shù)最多（P＜0.05）；中等負荷運動組低與大負荷運動組（P＜0.05）。

2.2 不同負荷運動對老齡大鼠海馬神經(jīng)Bcl－2、Bax表達

不同負荷運動組的各只老齡大鼠海馬神經(jīng)Bcl－2的陽性細胞表達數(shù)占其同一視野下總細胞數(shù)的比值情況（見表1），免疫組化表達圖（見圖1）。Bcl－2的免疫反應的陽性細胞通過20×10倍的光鏡下可觀察到主要定位在神經(jīng)元細胞的細胞漿和細胞膜，呈棕褐色顆粒。與對照組相比，小負荷運動組Bcl－2的表達最多（P＜0.01）；中等負荷組處于大負荷組與小負荷組之間，雖略高于對照組，但是二者之間沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；而大負荷運動組低于對照組（P＜0.01）。

不同負荷運動組的各只老齡大鼠海馬神經(jīng)Bax的陽性細胞表達數(shù)占其同一視野下總細胞數(shù)的比值情況（見表1），免疫組化表達圖（見圖2）。Bax的免疫反應的陽性細胞通過20×10倍的光鏡下可觀察到主要定位在神經(jīng)元細胞的細胞漿和細胞膜，呈棕褐色顆粒。與對照組相比，小負荷運動組海馬神經(jīng)Bax的表達最少（P＜0.05）；中等負荷組處于大負荷組與小負荷組之間，雖略高于對照組，但是二者之間沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；而大負荷運動組表達顯著增多（P＜0.01）。

圖1 海馬神經(jīng)Bcl－2表達情況

圖2 海馬神經(jīng)Bax表達情況

3 討論

在為期8周的游泳訓練結束后，老齡大鼠進行八臂迷宮實驗，記錄各組老齡大鼠每次完成八臂迷宮實驗的時間，來表示其學習記憶的效果，從而體現(xiàn)其學習記憶能力的差異。完成時間越短，說明其學習記憶能力越強、學習速度越快；如完成時間越長，則說明其學習記憶能力下降。記錄各組老齡大鼠進行八臂迷宮實驗時的工作記憶錯誤次數(shù)，來表示其學習記憶的效果，從而體現(xiàn)其學習記憶能力的差異。工作記憶錯誤出現(xiàn)的次數(shù)越少，說明其學習記憶能力越強、學習速度越快；如工作記憶錯次數(shù)越多，則說明其學習記憶能力下降。本研究結果顯示：小負荷運動組完成時間最短，工作記憶錯誤次數(shù)最少，說明長期堅持適宜負荷的運動鍛煉有助于提高學習記憶能力。

進行適宜負荷的體育鍛煉對提高學習記憶能力是有促進作用的，其發(fā)生機制為：經(jīng)常性的進行運動可以改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機能，使大鼠腦內(nèi)紋狀體、海馬、前額葉皮層及伏隔核的DA代謝加強，使記憶的物質(zhì)基礎發(fā)生變化，對發(fā)展智力起到促進的作用；與此同時，還可以通過逆轉突觸數(shù)量減少和突觸體膜流動性下降，提高大腦的工作效率，從而對延緩腦衰老起到重要作用。此外，堅持進行適宜的有氧運動，有助于加快人體的血液循環(huán)能力、并加快其氣體交換的能力，可以使全身的微細血管開放，這樣更充足的氧氣就可以供給給大腦，可以有效地改善大腦皮層神經(jīng)活動過程的興奮性以及各中樞之間的協(xié)調(diào)性，這也將對學習記憶能力的提高起到促進作用［6］。

Bcl－2作為一種抗凋亡蛋白，對MPT（即線粒體通透性轉變孔，mitochondria permenbility transition pore）的開放具有一定的調(diào)節(jié)作用，其存在形式為細胞器（如線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜）的整合膜蛋白；而Bax作為一種促凋亡蛋白，分布于細胞骨架上或者是胞漿中，形式為非活性。當死亡的信號刺激細胞后，促凋亡蛋白Bax就會出現(xiàn)構象的改變，由胞漿中轉至線粒體外膜，并與膜上的抗凋亡蛋白發(fā)生相互作用，使抗凋亡蛋白喪失對細胞凋亡的抑制作用，引起線粒體內(nèi)各種促凋亡因子的釋放，最終導致細胞凋亡［7］。

人們在對人類和動物的認知功能進行研究時，通常將海馬視為經(jīng)典區(qū)域并作為重點對象開展相關研究。目前已有部分研究指出，大鼠的海馬神經(jīng)元的凋亡是造成其認知功能受到損害的主要原因［8，9］。本研究中，在進行8周的不同負荷運動后發(fā)現(xiàn)，老齡大鼠海馬神經(jīng)Bcl－2和Bax的表達存在差異，多重比較后發(fā)現(xiàn)，小負荷運動組和中等負荷運動組Bcl－2的表達升高并伴隨Bax的表達降低，且小負荷運動組細胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生甚微，大負荷運動組情況則相反。

運動訓練可以激發(fā)細胞凋亡的發(fā)生［10］，其凋亡程度主要取決于運動負荷量的多少，通過Bcl－2和Bax表達的多少可以反映出細胞凋亡的情況。進行8周的運動后，不同的運動負荷會給老齡大鼠帶來不同的刺激致使其海馬神經(jīng)Bcl－2和Bax會出現(xiàn)不同的表達。其中小負荷運動組的大鼠其海馬神經(jīng)Bcl－2表達最多，Bax表達最少，而大負荷運動組的結果正好與之相反，說明老齡大鼠進行小負荷運動可以有效抑制海馬神經(jīng)細胞的凋亡，而長期的大負荷運動則會使其凋亡現(xiàn)象顯著增加。

通過研究發(fā)現(xiàn)，適宜的運動負荷可以對機體產(chǎn)生良性的影響。在一定的生理范圍內(nèi)，運動對老齡大鼠的學習記憶能力及抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡起到促進的作用。

［1］洪 岸.老年大鼠學習記憶減退的神經(jīng)過敏基礎［J］.生理科學進展，1995，26（3）：240.

［2］Wu A，Ying Z，Gomez－pinilla F.Docosahexaenoic acid dietary supplementation enhances the effects of exercise on synaptic plasticity and cognition［J］.Neuroscience，2008，155（3）：751.

［3］劉忠民，劉惠佳，宋 燕，等.不同運動負荷對大鼠海馬神經(jīng)c－fos表達的影響［J］.中國實驗診斷學，2011，15（6）：963.

［4］徐 波，季 瀏，林龍年，等.游泳訓練對大鼠學習記憶和腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2004，23（3）：261.

［5］趙 峰，李建平.不同負荷的運動訓練對大鼠血漿ADM、ET含量變化的影響及意義［J］.北京體育大學學報，2005，28（5）：631.

［6］王芳媛.體育運動對老年癡呆癥的預防及運動處方的制定［J］.遼寧休育科技，2005，27（2）：42.

［7］Gross A，McDonnekk JM，Korsmeyer SJ.Bcl－2family members and the mitochondria in apoptosis［J］.Genes Dev，1993，13（15）：1899.

［8］胡旺平，李雪梅，胡圣望.慢性應激對大鼠空間學習、記憶和海馬一氧化氮的影響［J］.中國心理衛(wèi)生雜志，2003，17：75.

［9］Lueassen PJ，Vollmann－Honsdorf GK，Gleisberg M，et al.Chronie Psyehosoeial stress differentially affeets apoptosis in hippoeampal subregions and cortex of the adult tree shrew［J］.Eur J Neurosci，2001，14：161.

［10］劉麗萍，等.游泳訓練后大鼠肝細胞SOD、MDA線粒體膜電位的變化與細胞凋亡［C］.第六屆科學大會論文集.

2014－10－17）

1007－4287（2015）06－0890－04

吉林省科技廳自然科學基金面上項目（項目編號201215037），吉林大學研究生創(chuàng)新基金資助項目（項目編號2014074）

＊通訊作者