陳 磊，鄭樹艷，黃永望＊

（1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻喉科，天津300060；2.天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院耳鼻喉科）

MTA2對喉癌細胞系Hep－2的增殖、遷移和侵襲的影響

陳 磊1，鄭樹艷2，黃永望1＊

（1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻喉科，天津300060；2.天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院耳鼻喉科）

目的 研究轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2（Metastasis－associated gene 2，MTA2）對喉癌細胞系Hep－2的增殖、遷移和侵襲的影響。方法 采用化學合成的針對MTA2基因的小干擾RNA（siRNA－MTA2）下調(diào)該基因的表達，采用Real time－PCR（RT－PCR）和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果，通過MTT、細胞劃痕實驗和Transwell法分別檢測MTA2對Hep－2細胞增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)果 將siRNA－MTA2轉(zhuǎn)染入Hep－2后，Hep－2細胞中MTA2mRNA和蛋白表達水平都明顯降低，細胞增殖能力顯著降低，細胞的遷移和侵襲能力顯著降低。結(jié)論 在喉癌細胞系Hep－2中MTA2與惡性增殖和侵襲性相關(guān)，有望成為喉癌早期診斷、分子治療的靶點。

喉癌；RNA；小分子干擾；轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2；Hep－2細胞

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0883）

喉癌是頭頸部常見上皮來源的惡性腫瘤，由于原癌基因的過表達，同時伴隨抑癌基因的突變?nèi)笔?，從而使腫瘤細胞逃避了正常生長的調(diào)控機制。MTA2（Metastasis－associatedgene 2，MTA2）是一個新發(fā)現(xiàn)的促癌基因，可以調(diào)節(jié)細胞骨架的構(gòu)建，還可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞凋亡。在一些惡性腫瘤中高表達，如肺癌、乳腺癌等［1，2］。但有關(guān)MTA2對喉癌細胞系Hep－2生物學行為的影響（細胞的增殖、遷移和侵襲）等的尚鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及其培養(yǎng) 喉癌細胞系Hep－2購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。Hep－2細胞于含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)液中，在5%CO2、37°C條件下培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 針對MTA2基因的小干擾RNA（siRNA－MTA2）以及體外化學合成的siRNA購自上海吉瑪公司，陰性對照（sicontrol）由上海吉瑪公司贈送。MTA2抗體、Transwell小室和DMEM均購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司），熒光定量PCR反應(yīng)采用Platinum Quantitative PCR SuperMix－UDG試劑盒（Invitrogen公司，美國），ABI 7500Sequence Detector儀器（ABI公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR檢測轉(zhuǎn)染后MTA2mRNA的表達 采用TRIZOL一步法快速提取細胞總RNA。取2μg總RNA于37℃在逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司），RNA酶抑制劑（Promega公司）作用下進行反轉(zhuǎn)錄合成CDNA，cDNA的合成體系參照文獻［7］。引物及探針均由上海生工生物工程公司合成。20 μl反應(yīng)體系中包括由40ng總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，10μl Platinum Quantitative PCR Super－Mix－UDG，10μmol／L的上下游引物和TaqMan探針各0.4μl。PCR反應(yīng)條件為50℃溫育2min，95℃預變性3min，95℃變性30s，58℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。CT值為熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)。每個樣本中每個基因的檢測均重復3次。△CT值為各樣本中目的基因的CT值與管家基因GAPDH的CT值之差，2－△CT則為該樣本中MTA2相對于GAPDH的mRNA表達量。

1.2.2 Western blot檢測細胞及組織中MTA2蛋白的表達 制備4%濃縮膠和10%分離膠的聚丙烯酰胺垂直平板凝膠，40μg總蛋白經(jīng)80V電壓電泳3h后，電轉(zhuǎn)70V3h轉(zhuǎn)印至PVDF膜。含5% ECL化學發(fā)光試劑盒的TBS－T（pH 8.3）室溫封閉1h后加入鼠抗人MTA2一抗，以β－actin為內(nèi)參。4℃平搖過夜，TBS－T洗膜6次后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1h，TBS－T洗膜6次，加ECL Western blot檢測試劑顯色1－2min，曝光X線膠片。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染 實驗分為①陰性對照組：轉(zhuǎn)染sicontrol。②實驗組轉(zhuǎn)染siRNA－MTA2。接種2 ×105個Hep－2細胞／孔于6孔板，以無抗生素的含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。100nmol／L siRNA－MTA2、sicontrol分別和2μl Lipofectamine 2000各溶于50 μl培養(yǎng)基，孵育5min后混合20min，緩慢滴入置于500μl OPTI－DMEM無血清培養(yǎng)基的細胞中，6 h后將培養(yǎng)液更換為含血清的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后用于基因表達檢測、蛋白表達和細胞生物學行為實驗。

1.2.4 MTT檢測轉(zhuǎn)染siRNA－MTA2和sicontrol后細胞增殖能力 Hep－2細胞分別轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體、siRNA－MTA2、sicontrol，48h后，胰酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整其濃度至1000－10000／孔。5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，設(shè)3個復孔，于24、48、72h后每孔加入10ml MTT溶液（5g／L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心用PBS沖2－3遍后。每孔加入1 0 0μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，在酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm處測量各孔的吸光度（A）值。

1.2.5 Transwell檢測轉(zhuǎn)染siRNA－MTA2和sicontrol后細胞的遷移和侵襲能力 將懸浮于500 μl無血清培養(yǎng)基的5×104個siRNA－MTA2和sicontrol細胞分別接種于不含Metrigel和含Metrigel的transwell上室，下層加入750μl含10%FBS的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)8h。取出transwell小室，用棉簽拭去上層未穿過的細胞，蘇木素染色后封片，于鏡下觀察穿孔細胞數(shù)目。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 MTT檢測各組吸光度（n＝5，A490，±s）

表1 MTT檢測各組吸光度（n＝5，A490，±s）

注：a與對照組比較，P＜0.01

1d3d5d7d9d陰性對照組0.25±0.05 0.50±0.10 2.35±0.14 3.65±0.30 4.2組別2.446 3.136 3.135 17.105 20.778 0±0.26實驗組0.25±0.08 0.45±0.11 2.18±0.21 3.06±0.34a3.45±0.41aF

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率的鑒定 實驗組中MTA2mRNA和蛋白表達水平較陰性對照組降低（F＝4.174；P＜0.01），見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA－MTA2和sicontrol后MTA2表達水平

2.2 沉默MTA2后對Hep－2細胞增殖的影響 培養(yǎng)1－5d時，各組細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義，培養(yǎng)7、9d時，實驗組細胞增殖能力較陰性對照組顯著降低（P＜0.01），見表1。

2.3 沉默MTA2對Hep－2細胞遷移的影響 轉(zhuǎn)染siRNA－MTA2實驗組細胞的遷移能力低于轉(zhuǎn)染sicontrol陰性對照組（F＝12.327，P＜0.01），見圖2。

圖2 Transwell檢測各組遷移能力的改變

2.4 沉默MTA2對Hep－2細胞侵襲能力的影響轉(zhuǎn)染siRNA－MTA2實驗組細胞的侵襲能力也低于轉(zhuǎn)染sicontrol陰性對照組（F＝22.431，P＜0.01），見圖3。

圖3 Transwell檢測各組侵襲能力的改變

3 討論

喉癌患者預后極差，傳統(tǒng)的治療方法，包括手術(shù)、放療和化療不能顯著改善患者生存。近年來，隨著腫瘤分子生物學技術(shù)的發(fā)展和對腫瘤發(fā)病機制的認識不斷加深，針對某些關(guān)鍵基因的分子靶向治療或?qū)肽承┮职┗虺蔀槟[瘤治療的熱點。

MTA2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個促癌基因，其基因定位于11q1213.1上，編碼668個氨基酸，其蛋白分子量是70kDa，有文獻報道MTA2參與核小體的的組成。Zhou等研究報道P300通過靶定MTA2促進結(jié)直腸癌細胞生長［3］。本研究發(fā)現(xiàn)MTA2在喉癌Hep－2細胞系中沉默MTA2表達后，Hep－2細胞的增殖能力、遷移和侵襲能力較陰性對照組顯著降低，這與Liu等［4］研究報道MTA2促進非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲主要是通過調(diào)節(jié)細胞粘附和細胞外基質(zhì)的降解來實現(xiàn)的報道移結(jié)果一致，提示MTA2是一個潛在的分子標志物，可作為檢測細胞轉(zhuǎn)移的輔助指標，但具體的分子機制還有待于進一步研究。

最新研究表明，MTA2依賴Tipin保持細胞S期復制的完整性［5］。在乳腺細胞系HEK－293中MTA2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)SETD6啟動子活性，并能促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為，提示其是一個潛在的促癌基因［6］。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默喉癌細胞Hep－2中MTA2的表達，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低喉癌細胞的增殖、運動和侵襲等生物學行為。因此筆者推測MTA2可能參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

綜上，MTA2在喉癌中發(fā)揮促癌基因的作用，其在喉癌中具有較高的診斷價值，可能作為喉癌基因治療的候選基因，但能否作為喉癌治療的靶基因，及其內(nèi)在分子生物學機制有待進一步研究。

［1］王術(shù)華，齊艷麗，張俊毅，等.MTA2在非小細胞肺癌中的表達及意義［J］.中國肺癌雜志，2010，13（8）：777.

［2］Cui Y1，Niu A，Pestell R，et al.Metastasis－associated protein 2is a repressor of estrogen receptor alpha whose overexpression leads to estrogen－independent growth of human breast cancer cells［J］.Mol Endocrinol，2006，20（9）：2020.

［3］Zhou J，Zhan S，Tan W，et al.P300binds to and acetylates MTA2 to promote colorectal cancer cells growth［J］.BBRC，2014，444，（3）：387.

［4］Liu SL，Han Y，Zhang Y，et al.Expression of metastasis associated protein 2（MTA2）might predict proliferation in no－small cell cancer［J］.Target oncol，2012，7（2）：135.

［5］Errico A，Aze A，Costanzo V.Mta2promotes Tipin－dependent maintenance of replication fork integrity［J］.Cell cycle，2014，13（13）：2120.

［6］Daniel J O，Neill1，Stuart Charles Williamson1，et al.SETD6controls the expression of estrogen－responsive genes and proliferation of breast carcinoma cells［J］.Epigenetics，2014，9（7）：942.

MTA2 influence on cell proliferation，migration，and invasion of laryngeal Hep－2 cells

CHEN Lei，ZHENG Shu－yan，HUANG Yong－wang1＊.（Department of laryngeal，the second Affiliated Hospital of Tianjin medical University Tianjin 300060，China）

Objective To evaluate the diagnostic value of MTA2in laryngeal to the role influence on cell biology of laryngeal Hep－2cells.Methods RT－PCR and Western blot were used to examine the expression of MTA2in MTA2 siRNA－transfected Hep－2cells.MTT and transwell were used to analyze the ability of proliferation，migration，and invasion in MTA2siRNA－transfected laryngeal Hep－2cells.Results knockdown of MTA2expression results decreased proliferation，migration，and invasion in Hep－2cells in vitro.Conclusion Our results may provide a strategy for blocking laryngeal and progression.

laryngeal；RNA，small interfering；MTA2；Hep－2cell

R73－37

A

2014－10－15）

1007－4287（2015）06－0883－03

＊通訊作者