任公平等

摘要：目的 觀察辣椒素對人大細胞肺癌NCI-H460細胞侵襲能力及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和Snail蛋白表達的影響，探討其抗非小細胞肺癌的可能機制。方法 體外培養(yǎng)NCI-H460細胞，以不同終濃度辣椒素進行處理，未加辣椒素為對照組。采用Hoechst33342核染色分析、Transwell小室細胞侵襲實驗及Western blot檢測，觀察辣椒素對NCI-H460細胞凋亡、侵襲能力及E-cadherin、Snail蛋白表達變化的影響。結果 與對照組比較，Hoechst33342核染色分析表明，辣椒素各濃度組可明顯誘導NCI-H460細胞凋亡（P<0.05）；Transwell體外侵襲實驗結果顯示，辣椒素可顯著抑制侵襲穿膜細胞數(shù)（P<0.05）；Western blot檢測結果表明，辣椒素各濃度組E-cadherin表達水平明顯升高、Snail表達水平明顯降低（P<0.05）。結論 辣椒素能明顯誘導NCI-H460細胞凋亡；降低Snail表達、刺激E-cadherin的表達從而抑制NCI-H460細胞侵襲能力，可能是其抗非小細胞肺癌的機制之一。

關鍵詞：辣椒素；非小細胞肺癌；侵襲；E-鈣黏蛋白；Snail蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）08-0055-04

Effects of Capsaicin on the Invasion Ability of Human Large Cell Carcinoma NCI-H460 and Expressions of E-cadherin and Snail REN Gong-ping1， LV Zheng-xin2， LIU Hong-yang3， LIANG Guo-ying4 （1.Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China；2.Jiamusi Hospital of TCM， Jiamusi 154002， China；3.Qiqihaer Hospital of TCM， Qiqihaer 161000， China；4.The First Affiliated Hospital to Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of capsaicin on the invasion ability of human large cell carcinoma NCI-H460 and the expressions of E-cadherin and Snail；To discuss the possible mechanisms of anti-non-small cell lung cancer. Methods NCI-H460 cells were cultured in vitro and treated with capsaicin at various concentrations， and no capsacin-treated group was set as control group. Effects of capsaicin on NCI-H460 apoptosis， its invasion ability， and the changes in protein expressions of E-cadherin and Snail were evaluated by Hoechst33342 nuclear staining assay， Transwell chamber invasion assay， and Western blot respectively. Results Compared with the control group， Hoechst33342 nuclear staining assay showed that capsaicin could induce NCI-H460 cell apoptosis （P<0.05）；Transwell invasion in vitro results showed that capsaicin could significantly inhibit invasion of penetrating cells （P<0.05）；Western blot analysis showed that E-cadherin expression level was significantly elevated and snail expression level significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Capsaicin can induce NCI-H460 cell apoptosis. Decrease the Snail expression and stimulate E-cadherin expression so as to inhibit the invasion ability of NCI-H460， which may be one of its mechanisms of anti-non-small cell lung cancer.

Key words：capsaicin；non-small cell lung cancer；invasion；E-cadherin；Snail

通訊作者：梁國英，E-mail：lianggy1976@163.com

據(jù)預測，到2020年，中國將有550萬新發(fā)肺癌病例，死亡人數(shù)將達400萬[1]。在肺癌病理學分型中，80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC），包括腺癌、鱗狀上皮細胞癌和大細胞癌，其侵襲和轉移能力是導致患者死亡及復發(fā)的主要原因，并使其成為當今世界上對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一[2]。近年來，關于辣椒素（capsaicin）抗癌作用的研究在國內外日益受到學者的高度重視。辣椒素是紅辣椒中的一種活性成分。有研究表明，辣椒素可以抑制癌癥細胞增殖、促進凋亡，因此，可作為一種藥物或傳統(tǒng)化療藥物的輔助用藥[3-5]。雖然辣椒素具有抗癌癥作用，但其有關NSCLC的研究鮮見報道。本實驗研究辣椒素對NCI-H460細胞侵襲能力及E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Snail蛋白表達的影響，探討其可能的作用機制，以期為NSCLC治療提供新思路，為臨床用藥提供實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 細胞

人大細胞肺癌NCI-H460細胞，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物及配制

辣椒素（純度>99%，美國Sigma公司），溶解于二甲基亞砜（DMSO），配成300 mmol/L溶液，-20 ℃保存。臨用時以完全培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基，美國HyClone公司；Hoechst33342、牛血清白蛋白（BSA）、DMSO，美國Sigma公司；Transwell小室，美國Corning公司；基質膠Matrigel，美國BD公司；E-cadherin、Snail、β-actin，上海浩然生物技術有限公司；E-cadherin鼠抗人單克隆抗體，美國ProMab公司；Snail兔抗人多克隆抗體，美國Santa Cruz公司；HRP標記抗鼠IgG二抗及HRP標記抗兔IgG二抗，上海碧云天公司。二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-20AIC），日本SANYO；熒光顯微鏡（BX53），日本OLYMPUS；電泳儀（DYCZ-20B），北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDox XRS），美國Bio-RAD科技。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

NCI-H460細胞保存在含有10%BSA的RPMI-1640營養(yǎng)培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。當NCI-H460細胞達80%匯合度時，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。按照細胞密度2×106個細胞/孔接種于超低吸附6孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48 h。收集懸浮的細胞，經EDTA處理制備成單細胞懸液，然后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞。收集對數(shù)生長期細胞，備用。

2.2 Hoechst33342核染色分析

取對數(shù)生長期NI-H460細胞，按照細胞密度1×104個/孔接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下過夜培養(yǎng)。次日，實驗組每孔加入終濃度為100、200、300 ?mol/L的辣椒素，對照組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。每組設6個平行孔。37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后，加入30 ?g/mL Hoechst33342 37 ℃，孵育30 min。熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。隨機選擇不同視野計數(shù)200個細胞，并分別計算凋亡細胞核數(shù)與正常細胞核數(shù)。實驗重復3次。計算凋亡率[凋亡細胞核數(shù)÷（正常細胞核數(shù)+凋亡細胞核數(shù)）×100%]。

2.3 Transwell小室體外侵襲實驗

參照文獻[6]方法，Transwell小室用前鋪上50 ?L 0.5%Matrigel膜基質37 ℃孵育過夜。取對數(shù)生長期NCI-H460細胞，將實驗組細胞用終濃度為100、200、300 ?mol/L的辣椒素在37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，對照組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。按照細胞密度5×104個細胞/接種于Transwell小室內室，并在Transwell小室下室加入含有10%BSA的完全培養(yǎng)液。孵育24 h后，取出Transwell小室，去除未穿膜細胞。甲醇固定15 min，以10 mg/mL Hoechst33342染色30 min。熒光顯微鏡計數(shù)穿過微孔膜的細胞數(shù)。每組細胞隨機計數(shù)10個視野，取其平均值。實驗重復3次。

2.4 Western blot檢測

取對數(shù)生長期NCI-H460細胞，將實驗組細胞用終濃度為100、200、300 ?mol/L的辣椒素，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，對照組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。用細胞裂解液（20 mmol/L Tris-HCl，1.5%Triton X-100，150 mmol/L NaCl，10%甘油，1 mmol/L Na4P2O7，50 mmol/L NaF，1 mmol/L PMSF）和蛋白酶抑制劑（5 ?mol/L AEBSF-HCl，5 ?mol/L EDTA，10 mmol/L leupeptin，1.5 mmol/L E-64，pH 7.4）裂解細胞后，收集裂解液，Bradford法測定蛋白質含量。取20 ?g蛋白質，加入等體積2×上樣緩沖液，95 ℃變性5 min。隨后進行7.5%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后，電轉至0.45 ?m硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的PBST（25 mmol/L Tris pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween20）封閉1 h，分別加入E-cadherin、 Snail抗體（1∶1000稀釋），4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次5 min。加入HRP標記的二抗（1∶2000稀釋）室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次5 min。按同法與β-actin抗體孵育。ECL化學發(fā)光試劑顯色，通過Bio-Rad凝膠成像進行目的條帶的表達檢測及分析。蛋白相對表達強度=目標蛋白表達強度/β-actin蛋白表達強度。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。正態(tài)計量數(shù)據(jù)用—x±s表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 辣椒素對NCI-H460細胞凋亡的影響

Hoechst33342染色結果顯示，辣椒素終濃度為300 ?mol/L時可見凋亡細胞碎片或者核固縮呈致密濃染、凋亡小體等凋亡典型特征性改變，細胞凋亡率為39.4%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。辣椒素終濃度為100、200 ?mol/L時未見細胞凋亡和壞死，細胞核形態(tài)正常，染色質均勻，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見圖1、表1。

4.2 辣椒素對NCI-H460細胞體外侵襲能力的影響

Transwell小室體外侵襲實驗結果顯示，與對照組比較，辣椒素終濃度為200、300 ?mol/L時，NCI-H460細胞的侵襲穿膜細胞數(shù)均顯著下降（P<0.05），并呈濃度依賴性；辣椒素終濃度為100 ?mol/L時， NCI-H460細胞的侵襲穿膜細胞數(shù)雖然減少，但與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見圖2、表2。

4.3 辣椒素對NCI-H460細胞E-鈣黏蛋白、Snail蛋白表達的影響

辣椒素終濃度為200、300 ?mol/L時，與對照組比較，E-cadherin表達水平顯著升高，Snail表達水平顯著降低（P<0.05），并呈濃度依賴性；辣椒素終濃度為100 ?mol/L時，與對照組比較，E-cadherin和Snail表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見圖3。

5 討論

辣椒素作為食物和傳統(tǒng)藥物已有幾千年的歷史，于1999年載入《美國藥典》[7]。辣椒素可通過多種途徑在體內外發(fā)揮抗癌癥作用，有研究表明，辣椒素可抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長[8]，辣椒素可誘導人黑色素瘤A375-S2細胞的凋亡[9]。然而，辣椒素對NSCLC是否具有抑制作用目前尚未明了。因此，本研究前期實驗以不同終濃度辣椒素作用于NCI-H460細胞，觀察辣椒素抗NSCLC效應。結果發(fā)現(xiàn)，辣椒素對NCI-H460細胞活率有一定抑制作用，提示辣椒素具有潛在的抗NSCLC效應。

癌癥的侵襲和轉移是導致癌癥患者死亡的主要原因。NSCLC轉移復發(fā)率更是居于原發(fā)性惡性腫瘤的前列[10]。因此，探討肺癌在分子水平的侵襲轉移機制尤為必要。增殖失控和惡性侵襲是癌癥細胞的兩大特征[11]。癌癥細胞的侵襲是一個復雜的過程，包括癌癥細胞與基質的黏附、基質成分的蛋白水解、癌癥細胞通過基質的缺損發(fā)生遷移3個步驟[12]。

上皮-間質轉變（epithelial-to-mesenchymal transitions，EMT）是促進癌癥細胞的原位侵襲和遠處轉移的一個關鍵因素，得到學者的廣泛認可和關注。EMT改變細胞的行為，但大多數(shù)情況下，提高癌癥轉移的能力，包括增強原發(fā)癌癥細胞的遷移及抑制癌癥細胞凋亡。EMT最重要的標志性變化是上皮細胞E-cadherin減少或丟失。E-cadherin是一種依賴Ca2+細胞間跨膜粘連糖蛋白分子，主要存在于上皮組織中，參與細胞間的連接，具有抑制癌癥侵襲轉移的作用。E-cadherin表達下調或抑制和功能喪失都可以啟動EMT，癌癥細胞經過這種細胞表型的轉化獲得更高的侵襲性[13-14]。在對E-cadherin表達調控的研究中發(fā)現(xiàn)，Snail是EMT中的主要調節(jié)蛋白，是含有鋅指結構的DNA結合蛋白。Snail能夠通過轉錄調節(jié)抑制E-cadherin基因的表達，引起上皮細胞向間質細胞表型的轉變，誘導EMT的發(fā)生[15]。本研究中，以辣椒素處理NCI-H460細胞，Transwell小室體外侵襲實驗結果顯示，辣椒素可顯著抑制侵襲穿膜細胞數(shù)，表明辣椒素可抑制癌癥細胞的侵襲。進一步通過Western blot檢測，結果顯示，辣椒素可減少NCI-H460細胞Snail表達，刺激E-cadherin的表達，逆轉EMT，揭示辣椒素可能通過抑制Snail表達、增加E-cadherin的表達來抑制癌細胞的遠處侵襲能力。同時Hoechst33342核染色分析還表明，辣椒素可誘導NCI-H460凋亡。

綜上所述，辣椒素具有明顯的NCI-H460細胞毒性作用，誘導其凋亡。而且辣椒素可通過降低Snail表達，刺激E-cadherin表達抑制NCI-H460細胞侵襲能力，可能是其抗NSCLC機制。

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（收稿日期：2015-03-13）

（修回日期：2015-03-28；編輯：華強）