蒿長(zhǎng)英等

摘要：目的 觀察糖網(wǎng)明目顆粒提取物對(duì)缺氧/高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926炎癥相關(guān)因子的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 以CoCl2和高濃度葡萄糖干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926復(fù)制缺氧和高糖模型，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，半定量RT-PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)基因表達(dá)，ELISA檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果 缺氧和高糖均能促進(jìn)EA.hy926細(xì)胞增殖，顯著上調(diào)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1α（IL-1α）基因和蛋白表達(dá)（P<0.05）。藥物干預(yù)后，細(xì)胞增殖能力降低，TNF-α、IL-1α基因和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 糖網(wǎng)明目顆粒提取物可能通過調(diào)控缺氧/高糖狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α、IL-1α等炎癥相關(guān)因子的mRNA和蛋白表達(dá)從而達(dá)到防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的目的。

關(guān)鍵詞：糖網(wǎng)明目顆粒提取物；糖尿病視網(wǎng)膜病變；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1α；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）08-0050-05

Effects of Tangwang Mingmu Granules on Expressions of TNF-α and IL-1α in Vascular Endothelial Cellsunder Hypoxia/High Glucose HAO Chang-ying1， CHEN Ming-xia2， GUO Ping3， MA Wen-bin1， LV Hai-bo3， DU Pei-pei1， ZHEN Lin-na3， LIU Ye4， LIAN Zeng-lin4 （1.Handian Group， Beijing Red Sun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Beijing 100103， China；2.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；3. Handian Group，Beijing Handian Pharmaceutical Co.， Ltd.， Beijing 100103， China；4.Beijing Handian Academy of Chinese Medicine， Beijing 100103， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Tangwang Mingmu Granules on inflammation- associated cytokines in vascular endothelial cells EA.hy926 under hypoxic/high glucose. Methods CoCl2 and high glucose were used to make the hypoxic and high glucose model in human umbilical vein endothelial cell line EA.hy926. EA.hy926 cell proliferation was measured by MTT method. Gene and protein expression levels of inflammatory factors were detected by semi-quantitative RT-PCR and ELISA assay. Results Both hypoxia and high glucose promoted EA.hy926 cell proliferation. The gene and protein expressions of TNF-α and IL-1α were significantly up-regulated under the same condition （P<0.05）. The cell proliferation， TNF-α， IL-1α mRNA and protein expression levels were significantly reduced by treatment of Tangwang Mingmu Granules （P<0.05）. Conclusion The preventive and therapeutic effect of Tangwang Mingmu Granules on diabetic retinopathy might be related to down-regulate the expression of inflammation-associated cytokines of mRNA and protein， such as TNF-α and IL-1α.

Key words：Tangwang Mingmu Granules；diabetic retinopathy；tumor necrosis factor-α；interleukin-1α；human umbilical vein endothelial cell

基金項(xiàng)目：北京市科技計(jì)劃“十病十藥”中藥專項(xiàng)（Z121102001112007）

通訊作者：連增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com

糖網(wǎng)明目顆粒是基于中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院高健生教授治療糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）的密蒙花方開發(fā)的中藥6類新藥[1]。臨床觀察顯示，該方對(duì)提高DR患者視力、改善視疲勞等臨床癥狀及眼底血管狀態(tài)療效顯著[2-3]。本課題前期研究結(jié)果表明，優(yōu)化工藝制備的糖網(wǎng)明目顆粒提取物與傳統(tǒng)水煎煮工藝比較能明顯改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管病理學(xué)狀態(tài)，降低血管生成相關(guān)因子的蛋白水平[4]。本實(shí)驗(yàn)采用血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬DR缺氧/高糖病理環(huán)境，進(jìn)一步探討缺氧/高糖狀態(tài)下糖網(wǎng)明目顆粒提取物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926炎癥相關(guān)因子的作用效果，并闡釋該藥防治DR的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy 926，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物

糖網(wǎng)明目顆粒處方由女貞子、烏梅、黃連、密蒙花、肉桂、黃芪、益母草組成，飲片購于安國市萌露中藥飲片有限公司，女貞子、烏梅、黃連、密蒙花均產(chǎn)于四川，肉桂產(chǎn)于廣西，黃芪產(chǎn)于內(nèi)蒙，益母草產(chǎn)于河北，經(jīng)北京漢典中醫(yī)研究院劉曄老師鑒定符合2010年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。糖網(wǎng)明目顆粒提取物由北京漢典中醫(yī)研究院提供，采取醇提、水提相結(jié)合的方法，將各藥材中主要藥效物質(zhì)充分提取，最后經(jīng)噴霧干燥制成提取物。

1.3 試劑

胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；高糖DMEM培養(yǎng)液，Hyclone，SH30022.01B；0.25%胰蛋白酶， Hyclone，SH30042.01B；DMSO，Amresco，0231；青鏈霉素混合液，Solarbio，P1400-100；D-葡萄糖，天津市福晨化學(xué)試劑廠；MTT，Amresco，0793-1g；PCR試劑盒， TaKaRa，RR019A；ELISA試劑盒，北京鑫方程生物技術(shù)有限公司；CoCl2·6H2O，Sigma，C8661-25G；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液管。

1.4 儀器

YT-CJ-2ND型超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司），MCO-175CO2培養(yǎng)箱（SANYO），BDS200倒置相差顯微鏡（奧特光學(xué)），MULTLSKAN MK3酶標(biāo)儀（Thermo），DPL-ⅡA型噴霧制粒儀（重慶精工制藥機(jī)械有限責(zé)任公司），LXJ-ⅡA型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），BIOMATE型紫外可見分光光度計(jì)（Thermo）， JY600電泳儀（北京君意東方電子設(shè)備有限公司）， ChampGel5000型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），GE4852型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)缺氧/高糖細(xì)胞增殖能力

EA.hy926細(xì)胞第3代經(jīng)胰酶消化，用普通培養(yǎng)液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液）稀釋成2.5×104/mL細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)過夜后進(jìn)行分組。空白組換用普通培養(yǎng)液，缺氧組換用CoCl2培養(yǎng)液，缺氧糖網(wǎng)明目顆粒干預(yù)組（缺氧+TWK組）換用CoCl2+糖網(wǎng)明目顆粒培養(yǎng)液，高糖組換用高糖培養(yǎng)液，高糖糖網(wǎng)明目顆粒干預(yù)組（高糖+TWK組）換用高糖+糖網(wǎng)明目顆粒培養(yǎng)液。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加上述培養(yǎng)液200 μL，培養(yǎng)24 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，室溫振蕩15 min，混勻。待沉淀完全溶解后，用濾光片為492 nm酶標(biāo)儀測(cè)定光密度（OD值）。計(jì)算抑制率。抑制率（%）=[OD值空白孔-OD值測(cè)量孔）÷（OD值空白孔-OD值調(diào)零孔）]×100%。

糖網(wǎng)明目顆粒培養(yǎng)液制備：精密稱定糖網(wǎng)明目顆粒提取物0.470 1 g，置50 mL離心管中，于超凈臺(tái)內(nèi)加40 mL無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，渦旋震蕩使藥物溶解，靜置30 min后混勻，以5000 r/min離心20 min，吸取上清液，用0.45 μm濾器無菌條件下過濾后，加入4.44 mL FBS，混勻，制成貯存液，封口，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩４藭r(shí)貯存液含濃度為10 mg/mL，含10%FBS。臨用時(shí)將貯存液梯度稀釋至所需濃度2.5 mg/mL。

CoCl2培養(yǎng)液制備：精密稱定CoCl2·6H2O 0.023 7 g，加10 mL超純水，溶解，過濾，4 ℃保存，即得10 mmol/L CoCl2母液。臨用時(shí)用相應(yīng)液體稀釋至50 μmol/L，混勻，進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。

D-葡萄糖培養(yǎng)液制備：精密稱定0.459 0 g D-葡萄糖，放入36 mL高糖DMEM培養(yǎng)液中，混勻，溶解，過濾，加4 mL FBS，混勻，4 ℃密閉保存。此時(shí)，含葡萄糖100 mmol/L，含10%體積分?jǐn)?shù)的FBS。臨用時(shí)用相應(yīng)液體稀釋至40 mmol/L，混勻，進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)缺氧/高糖細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)：將3×106個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，普通培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜后，根據(jù)分組換用不同培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后棄培養(yǎng)液，4 ℃預(yù)冷的PBS洗3遍，加入1 mL RNAiso Plus，刮取細(xì)胞，吸至冰盒預(yù)冷的1.5 mL EP中，加入1/5體積的氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15 s，直至溶液充分乳化。室溫靜置5 min，4 ℃、13 500 r/min離心15 min。取出離心管，將上層透明水層吸至另一新的離心管中。加入等體積異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻。室溫靜置10 min，4 ℃、13 500 r/min離心10 min。小心倒去上清，向含有沉淀的離心管中緩慢加入-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇1 mL，小心清洗沉淀。4 ℃、13 500 r/min離心5 min。除去上清，室溫干燥2 min，加入20 μL 1‰DEPC水溶解沉淀。紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度，用1‰DEPC水調(diào)整總RNA至相同濃度500 ng/μL。

cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：冰上配制10 μL RT反應(yīng)體系[2 μL MgCl2，1 μL RT Buffer，1 μL dNTP Mixture， 0.25 μL RNase Inhibitor，0.5 μL OligodT- Adaptor Primer，1 μL總RNA 樣本，3.75 μL RNase Free dH2O， 0.5 μL AMV Reverse Transcriptase]；反應(yīng)條件：30 ℃、10 min，50 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min；半定量PCR反應(yīng)引物，北京賽百盛合成。結(jié)果見表1。

瓊脂糖凝膠電泳及圖像分析：1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Lane ID凝膠圖像分析軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析測(cè)定，基因表達(dá)水平以β-actin為參比。

2.3 ELISA檢測(cè)缺氧/高糖細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞分組及藥物干預(yù)同“2.1”項(xiàng)。藥物干預(yù)24 h后，吸取細(xì)胞上清液至預(yù)冷的1.5 mL無菌EP管中，同組混勻，封口，-80 ℃保存?zhèn)溆谩CA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，用PBS調(diào)整總蛋白至相同濃度。標(biāo)準(zhǔn)品按照說明書稀釋5個(gè)梯度，各梯度每孔加樣均為50 μL。分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔，每組3個(gè)復(fù)孔。向待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測(cè)樣品10 μL，混勻。封板膜封板后于37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄液體，甩干，每孔加滿洗滌液，重復(fù)洗5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL。封板膜封板后37 ℃溫育30 min，如前法重復(fù)洗5次，拍干。每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)各孔光密度（OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品OD值代入方程，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 糖網(wǎng)明目顆粒提取物對(duì)缺氧/高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

與空白組比較，用CoCl2干預(yù)EA.hy926細(xì)胞造成缺氧狀態(tài)24 h后，該組細(xì)胞增殖能力顯著提高（P<0.05），提示缺氧狀態(tài)可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖；當(dāng)加入糖網(wǎng)明目顆粒提取物干預(yù)后，細(xì)胞增殖能力被顯著抑制（P<0.05），提示糖網(wǎng)明目顆粒提取物能夠抑制缺氧狀態(tài)導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。同樣，用40 mmol/L葡萄糖干預(yù)EA.hy926細(xì)胞24 h后，與空白組比較，該組細(xì)胞增殖能力顯著提高（P<0.05），提示高糖狀態(tài)可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；以糖網(wǎng)明目顆粒提取物干預(yù)高糖狀態(tài)細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖能力被顯著抑制（P<0.05）。見圖1。

4.2 糖網(wǎng)明目顆粒提取物對(duì)缺氧/高糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子-α基因和蛋白表達(dá)的影響

血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧24 h后，TNF-α基因及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05）；經(jīng)糖網(wǎng)明目顆粒提取物干預(yù)24 h后，TNF-α基因及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），見圖2。同樣，40 mmol/L葡萄糖干預(yù)細(xì)胞24 h后，TNF-α基因及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05）；經(jīng)糖網(wǎng)明目顆粒提取物干預(yù)24 h后，TNF-α基因及蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），見圖3。

4.3 糖網(wǎng)明目顆粒提取物對(duì)缺氧/高糖誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-1α基因和蛋白表達(dá)的影響

血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧24 h后，IL-1α基因及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05）；經(jīng)糖網(wǎng)明目顆粒提取物干預(yù)24 h后，該基因及蛋白水平均顯著降低（P<0.05），見圖4。同樣，高糖干預(yù)細(xì)胞24 h后，IL-1α基因及蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05）；經(jīng)糖網(wǎng)明目顆粒提取物干預(yù)24 h后，該基因及蛋白水平均顯著降低（P<0.05），見圖5。

5 討論

糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，常導(dǎo)致血液流變性及微循環(huán)障礙和代謝紊亂，引起組織水腫、缺血和缺氧，導(dǎo)致血管和神經(jīng)病變[5]。DR是糖尿病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是主要的致盲疾病之一，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，DR中有很多炎癥因素參與，因而提出DR是一種炎癥疾病[6]。本實(shí)驗(yàn)采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926模擬DR病變過程中的缺氧/高糖狀態(tài)，藉以研究糖網(wǎng)明目顆粒對(duì)該病發(fā)病過程中炎癥因子的影響。

TNF-α在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面廣泛分布，與視網(wǎng)膜血管通透性、血管細(xì)胞增殖及眼內(nèi)新生血管形成有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型中，TNF-α等炎癥因子水平明顯高于正常對(duì)照組[7]，2型糖尿病早期視網(wǎng)膜病變患者血清中TNF-α表達(dá)維持在高水平[8]。

IL-1可能是視網(wǎng)膜炎癥引起血視網(wǎng)膜屏障損害的重要因子，其可引起多核細(xì)胞和單核細(xì)胞向視網(wǎng)膜血管外遷移，血清蛋白向玻璃體內(nèi)彌散及紅細(xì)胞向玻璃體內(nèi)滲漏等，造成視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞間出現(xiàn)許多大裂隙，使血-視網(wǎng)膜屏障出現(xiàn)缺損，導(dǎo)致局部水腫、滲出、出血和細(xì)胞浸潤，其對(duì)TNF-α促進(jìn)新生血管形成的效應(yīng)也具有協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)，KK/Upj-Ay小鼠血液和視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β等炎癥因子基因和蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組[9]。采用鏈脲佐菌素建立的SD大鼠糖尿病模型發(fā)現(xiàn)，早期DM大鼠視網(wǎng)膜中IL-6、IL-1α、TNF-α等mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于正常組[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖網(wǎng)明目顆粒提取物不僅能抑制缺氧/高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而且能顯著降低缺氧/高糖誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1α的基因和蛋白表達(dá)水平。提示該制劑可能通過抑制糖尿病缺氧/高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)炎癥因子，達(dá)到防治DR的作用效果。

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（收稿日期：2014-12-01）

（修回日期：2014-12-22；編輯：華強(qiáng)）