于秀菊，高淑媛，程笳琪，趙兵令，赫曉燕，董常生

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多肽類生長(zhǎng)因子，由α重鏈和β輕鏈組成。其受體是由原癌基因編碼的具有酪氨酸集激酶活性的蛋白 c－met［1］。大量研究表明，HGF/c－met在哺乳動(dòng)物間充質(zhì)－上皮互作的多種組織中起調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化和存活的作用［2，3］。毛囊具有周期性的生長(zhǎng)特性，根據(jù)其毛囊各組分在形態(tài)上的變化，將其分為毛發(fā)生長(zhǎng)期、退化期和休止期［4，5］。真皮乳頭(由間充質(zhì)衍生)的成纖維細(xì)胞與表皮角質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用在毛囊周期性生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要的作用［6］。

體外實(shí)驗(yàn)證明HGF/c－met對(duì)毛囊生長(zhǎng)具有促進(jìn)的作用。Shimaoka等［7］在體外培養(yǎng)的人毛囊中添加一定濃度的HGF后，發(fā)現(xiàn)毛囊的長(zhǎng)度增長(zhǎng)，DNA合成能力增強(qiáng)，證明HGF能夠刺激毛囊的生長(zhǎng);過表達(dá)HGF的轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)毛囊發(fā)育提前，退化期顯著推遲，皮膚組織中的毛囊數(shù)量顯著增加的現(xiàn)象［8］。但是，內(nèi)源性的 HGF/c－met信號(hào)是否參與毛囊的周期性變化還不清楚。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)HGF及其受體c－met在ICR小鼠毛囊的生長(zhǎng)期、退化期和休止期進(jìn)行組織定位，證明HGF/c－met在毛發(fā)生長(zhǎng)過程發(fā)揮著重要的作用，為HGF/c－met的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠雌、雄各10只，體重18～22 g，2月齡。均購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009－0004】。交配受孕后將雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)直至生產(chǎn)，選定同一天出生的三窩ICR小鼠，在出生后的第15天和17天，第19天和20天、第25天和26天，每窩各取一只小鼠，處死后取其背部皮膚，固定于Bouin氏液中，24 h后更換為70%酒精，通過梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋，切成5 μm厚的切片，用于免疫組織化學(xué)研究。

1.2 免疫組織化學(xué)

石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水至蒸餾水后，3%H2O2去除內(nèi)源性的過氧化物酶，PBS洗切片5 min×3次;滴加5%非免疫山羊血清，封閉30 min;甩掉封閉液后滴加1∶100兔抗HGF多克隆抗體(1∶100兔抗 c－met多克隆抗體)，室溫放置 30 min，4℃過夜后，37℃孵育30 min，PBS 洗切片 5 min×3次;然后按照下面的程序進(jìn)行，HGF:滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃，20 min;用PBS緩沖溶液沖洗3 min ×3次;顯色:BCIP/NBT(1∶20比例稀釋)混勻后加至切片，室溫顯色20 min;蒸餾水洗滌后核固紅輕度復(fù)染。水洗，干燥后水溶性封片劑封片。c－met:滴加 1∶100 HRP－山羊抗兔 IgG，37℃ 孵育 30 min，PBS洗切片5 min ×3次;滴加DAB顯色劑顯色3～5 min，PBS沖洗5 min ×3次;蘇木精輕度復(fù)染，梯度酒精脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片。非免疫山羊血清代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 圖像分析

應(yīng)用 Image－Pro Plus 6.0 軟件對(duì)HGF 和 c－Met蛋白在各期小鼠皮膚組織中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行光密度的測(cè)定，每個(gè)時(shí)期的小鼠皮膚組織取3張切片，每張切片取5個(gè)視野，得到陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值。所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0(美國(guó)SPSS公司)，應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)過測(cè)定所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，分析結(jié)果用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)來表示。

2 結(jié)果

2.1 HGF在ICR小鼠毛囊生長(zhǎng)周期中的定位和表達(dá)量分析

HGF的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在真皮乳頭和皮脂腺，表達(dá)量隨時(shí)期的不同而不同。在毛囊的生長(zhǎng)期，毛纖維生長(zhǎng)旺盛，毛乳頭的直徑顯著大于根鞘部，HGF呈強(qiáng)陽(yáng)性的表達(dá)，紫色陽(yáng)性物在真皮乳頭著色較深(圖1A);到達(dá)退化期，毛囊萎縮成杵形的圓狀結(jié)構(gòu)，沒有可見的HGF的陽(yáng)性表達(dá)物(圖1B);在休止期－生長(zhǎng)期過渡中，可見新毛向上推移，接近杵形毛，杵形毛最終會(huì)脫落，新毛會(huì)占據(jù)舊毛穴，HGF的陽(yáng)性表達(dá)有所增強(qiáng)，在真皮乳頭和皮脂腺均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖1C)。對(duì)照組中均未見陽(yáng)性反應(yīng)(圖1D－1F)。生長(zhǎng)期的平均吸光度是(0.17±0.0164)，休止期－生長(zhǎng)期測(cè)定的平均吸光度值是(0.1168±0.0067)。

2.2 c-met在ICR小鼠毛囊生長(zhǎng)周期中的定位和表達(dá)量分析

c－met的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在根鞘部和表皮。在毛囊的生長(zhǎng)期，毛纖維c－met呈強(qiáng)陽(yáng)性的表達(dá)，棕黃色陽(yáng)性物在毛基質(zhì)和根鞘部著色較深(圖2A);在退化期，僅有微弱的c－met的陽(yáng)性信號(hào)(圖2B);在休止期－生長(zhǎng)期過度中，c－met的陽(yáng)性表達(dá)有所增強(qiáng)，在根鞘部和表皮中均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖2C)。對(duì)照組中均未見陽(yáng)性反應(yīng)(圖2D－2F)。3個(gè)時(shí)期的平均吸光度值分別是(0.31±0.0107)、(0.05±0.0041)和(0.23±0.0065)。

3 討論

注:1.根鞘;2.皮脂腺;3.真皮乳頭;4.表皮;A－C.實(shí)驗(yàn)組;D－F.對(duì)照組;A，D.毛囊生長(zhǎng)初期;B，E.毛囊生長(zhǎng)中期;C，F(xiàn).毛囊生長(zhǎng)末期。圖1 毛囊生長(zhǎng)周期不同時(shí)期HGF的免疫組織化學(xué)染色Note.1.Root sheath;2.Sebaceous glands;3.Dermal papilla;4.Epidermis;A－C.Experiment groups;D－F.Control groups;A，D.Anagen;B，E.Catagen;C，F(xiàn).Telogen.Fig.1 The expressions of HGF protein in different phases of the hair follicle cycle in ICR mice

毛囊是毛發(fā)生長(zhǎng)依賴的微小器官，其周期性變化與間充質(zhì)－上皮的相互作用有密切的關(guān)系，與角質(zhì)化細(xì)胞的分化，增殖和凋亡相關(guān)［9］。大量研究證明，毛囊的生長(zhǎng)受到 Shh(Sonic Hedgehog)、β連環(huán)蛋白(β－catenin)、淋巴增強(qiáng)因子(lymphoid enhancer factor－1，lef－1)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，bmp)家族成員等很多因子的調(diào)控［4，10，11］。同時(shí)，黑色素細(xì)胞活性與數(shù)量也隨著毛囊的生長(zhǎng)呈現(xiàn)周期性的變化［12］。本實(shí)驗(yàn)證明HGF主要定位于小鼠毛囊的毛乳頭，毛乳頭是皮膚間充質(zhì)衍生形成的特殊結(jié)構(gòu)，由成纖維細(xì)胞組成。Yamaguchi等［13］實(shí)驗(yàn)證明HGF是一種由成纖維細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子，通過與黑色素細(xì)胞上的受體作用調(diào)控黑色素的產(chǎn)生。而c－met主要表達(dá)在小鼠毛囊的毛基質(zhì)、根鞘部和表皮中。毛囊的黑色素細(xì)胞主要位于毛基質(zhì)和根鞘部，其中毛基質(zhì)的黑色素細(xì)胞對(duì)毛色起到?jīng)Q定性的作用，相對(duì)于毛基質(zhì)來說，根鞘部?jī)H含有很少量的黑色素細(xì)胞［14］。HGF/c－met在 ICR 毛囊生長(zhǎng)的不同時(shí)期呈現(xiàn)不同的表達(dá)量。在生長(zhǎng)期，毛囊生長(zhǎng)旺盛，HGF和c－met表達(dá)量達(dá)到最高值;到退化期時(shí)，整個(gè)毛囊萎縮成杵形的圓狀結(jié)構(gòu)，HGF完全沒有陽(yáng)性信號(hào)，c－met表達(dá)信號(hào)非常微弱，在休止期向下一個(gè)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化過程中，HGF和c－met信號(hào)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)表明，HGF/c－met與ICR小鼠毛囊的周期性生長(zhǎng)過程中起調(diào)控作用。

體外實(shí)驗(yàn)證明HGF/c－met能夠增加毛囊的數(shù)量、促進(jìn)毛囊的生長(zhǎng)和延遲退化期的到達(dá)時(shí)間［7，8］。本實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)源性的HGF/c－met信號(hào)調(diào)控毛囊的周期性變化。Balkovetz等證實(shí)HGF刺激β－catenin的的合成，從而引起表皮中的細(xì)胞核內(nèi)β－catenin的積累。前期的實(shí)驗(yàn)證明β－catenin是毛囊生長(zhǎng)必需的分子之一，維持和促進(jìn)毛囊的生長(zhǎng)［4］。由此推測(cè)HGF與c－met的相互作用以間充質(zhì)和上皮的互作為組織基礎(chǔ)，HGF可能通過調(diào)節(jié)β－catenin來發(fā)揮調(diào)控毛囊的生長(zhǎng)。具體的分子作用機(jī)制是我們下一步研究的靶點(diǎn)。

注:1.根鞘;2.毛基質(zhì);3.真皮乳頭;4.表皮;A～C.實(shí)驗(yàn)組;D～F.對(duì)照組;A，D.毛囊生長(zhǎng)初期;B，E.毛囊生長(zhǎng)中期;C，F(xiàn).毛囊生長(zhǎng)末期。圖2 毛囊生長(zhǎng)周期不同時(shí)期c－met的免疫組織化學(xué)染色(×20)Note.1.Root sheath;2.Hair matrix;3.Dermal papilla;4.Epidermis;A－C.Experiment groups;D－F.Control groups;A，D.Anagen;B，E.Catagen;C，F(xiàn).Telogen.Fig.2 Expression of c－met protein in different phases of the hair follicle cycle in ICR mice

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