劉建生，陶玉芬，李曉菲，李超Δ，李曉飛，孫曉梅，代解杰* ，劉紅旗*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所感染和免疫實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心，云南 昆明 650118)

哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒(mammalian reovirus，MRV)屬于呼腸孤病毒科呼腸孤病毒屬成員。MRV是無(wú)包膜雙鏈RNA(dsRNA)病毒，有雙層衣殼，呈20面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，基因組由10條獨(dú)立離散的dsRNA組成。根據(jù)基因組電泳帶型分布，十個(gè)基因組片段分成L(大)、M(中)和S(小)三組，其中L組包括 L1，L2和 L3三個(gè)片段，M 組包括 M1、M2和 M3三個(gè)片段，S組包括 S1、S2、S3和S4四個(gè)片段。片段S1編碼蛋白sigma1［1］，盡管該蛋白在整個(gè)病毒粒子中僅僅含有24個(gè)分子，但由于其分布在病毒粒子的表面，因此具有很重要的作用，如:細(xì)胞受體的配體［2］、血凝素［3］、誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生［4］、決定組織噬性和毒力［5，6］、介導(dǎo)病毒粒子與細(xì)胞微管之間的結(jié)合［7］以及抑制宿主細(xì)胞 DNA的合成［8］等。該蛋白的另一個(gè)有趣的特征是，它是唯一一個(gè)與病毒血清型特異性有關(guān)的蛋白［9－11］，根據(jù)該蛋白可以將MRV分為3個(gè)明顯不同的血清型，而且編碼該蛋白的基因S1在進(jìn)化中起重要作用。根據(jù)血清中和試驗(yàn)和血凝抑制能力，呼腸病毒屬可分為3個(gè)血清型，其原型株分別為Ⅰ型 T1L、Ⅱ型 T2J、Ⅲ型T3D［12，13］。

MRV最早于1954年從健康兒童的糞便中分離得到［14］。迄今為止，MRV已在許多健康或發(fā)病的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，包括人、鼠、貓、犬、豬、牛、蝙蝠及樹(shù)鼩［15－22］等多種動(dòng)物，通常情況下，該病毒能感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物，但一般僅在幼體感染者中引起疾?。?3］。猴腎細(xì)胞(Vero)是目前分離和培養(yǎng)該病毒最常用的細(xì)胞。

本研究在對(duì)實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩腹瀉糞便樣本進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)過(guò)程中，同一樹(shù)鼩糞便樣品在不同細(xì)胞上分離獲得具有不同S1基因片段電泳帶型特征的病毒株，并以該樹(shù)鼩呼腸病毒分離株為材料，獲得了S1基因組片段的全長(zhǎng)cDNA克隆并完成了序列測(cè)定，生物信息學(xué)分析，可確認(rèn)該研究中實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩混合感染了呼腸病毒I型和Ⅲ型病毒。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩腹瀉糞便樣本由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心采集提供。病毒保存在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所感染與免疫學(xué)研究室。

1.2 病毒分離培養(yǎng)

用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備10%糞便懸液，6137 r/min離心20 min后，上清經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，然后取200 μL濾液分別接種至6孔板中已長(zhǎng)成致密單層的LLC－MK2、KMB17和Vero細(xì)胞，傳代適應(yīng)培養(yǎng)至第3代，均產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)。收集細(xì)胞病毒培養(yǎng)物，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒電鏡檢查

建立穩(wěn)定的細(xì)胞－病毒培養(yǎng)體系后，分別收集培養(yǎng)上清和病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡檢查。培養(yǎng)上清直接鏡檢:取培養(yǎng)上清，3000 r/min離心20 min，棄沉淀;離心上清再經(jīng)12000 r/min離心20 min，去上清，病毒沉淀經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后電鏡觀(guān)察。病毒感染細(xì)胞超薄切片透射電鏡觀(guān)察:收集病毒感染3～4 d的細(xì)胞，1500 r/min低速離心15 min，棄去上清，加入4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液1 mL，不沖散細(xì)胞團(tuán)塊，進(jìn)行超薄切片及透射電鏡檢查。

1.4 輪狀病毒檢測(cè)

按照A群輪狀病毒診斷試劑盒(膠體金法)(北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司)使用說(shuō)明檢測(cè)病毒分離培養(yǎng)樣品。

1.5 病毒RNA提取

按Axygen Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit操作說(shuō)明提取培養(yǎng)上清中病毒RNA。用60 μL無(wú)RNA酶的超純水重懸。保存于－80℃?zhèn)溆?用于RT－PCR 和 RNA－PAGE 電泳)。

1.6 病毒RNA電泳及硝酸銀染色

配制聚丙烯酰胺凝膠:10%分離膠和5%濃縮膠，病毒RNA上樣每孔15 μL，在1× TBE緩沖液中，于90 V電壓電泳9 h后進(jìn)行硝酸銀染色分析。

1.7 引物設(shè)計(jì)及合成

依據(jù)呼腸病毒原型株T1L株(GenBank登錄號(hào)EF494445)，T2J株(GenBank登錄號(hào) M10261)和T3D株(GenBank登錄號(hào)HM159619)，設(shè)計(jì)針對(duì)哺乳動(dòng)物呼腸病毒基因組片段S1全長(zhǎng)的引物(表1)。引物Invitrogen上海公司合成。

表1 呼腸病毒S1全長(zhǎng)基因序列引物Tab.1 Primers used for RT－PCR of reovirus S1 complete sequences

1.8 病毒基因組S1節(jié)段全長(zhǎng)基因RT-PCR擴(kuò)增

RT－PCR試劑購(gòu)自TaKaRa寶生物大連有限公司。RT反應(yīng):在PCR反應(yīng)管中依次加入下列成分:病毒RNA模板5 μL，滅菌蒸餾水3 μL，下游特異引物 1 μL(20 μmol/L)，dNTP mix 1 μL(10 μmol/L)，混勻，65℃作用5 min，冰上急冷2 min;再加入5×PrimeScript buffer 4 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，PrimeScript Transcriptase 1 μL，滅菌蒸餾水4.5 μL，混勻，42℃ 45 min，70℃ 15 min。PCR 反應(yīng)采用25 μL體積體系，依次加入 TaKaRa Premix Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL(20 μmol/L)，病毒cDNA模板5 μL，滅菌超純水補(bǔ)足至25 μL。按如下反應(yīng)程序擴(kuò)增:94℃ 預(yù)變性 5 min;94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃1min 40 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，于1.0%瓊脂糖電泳分析。

1.9 病毒S1全長(zhǎng)基因克隆

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將預(yù)期目的條帶膠回收，克隆到pMD－T載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆菌落在氨芐抗性培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，提取質(zhì)粒。鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒交由上海生工生物工程有限公司序列測(cè)定。

1.10 生物信息學(xué)分析

通過(guò)MEGA6.0軟件中blast功能收集與本研究相關(guān)的序列，選擇具有S1基因片段全長(zhǎng)的序列用于后續(xù)分析。根據(jù)Genbank的信息和發(fā)表的文獻(xiàn)所得到的信息，給每個(gè)分離株序列一個(gè)名稱(chēng):血清型/分離株/分離地點(diǎn)/分離年代－Genbank號(hào)(gi號(hào))。通過(guò)MEGA6.0軟件中Maximum Likelihood方法繪制遺傳發(fā)生樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉樹(shù)鼩糞便樣品能引起明顯的細(xì)胞病變

不同的病毒可能適應(yīng)不同的細(xì)胞株，為了能夠盡可能多地分離到樹(shù)鼩腹瀉糞便中的病毒。我們將處理后的糞便樣品分別在 KMB17、Vero和 LLCMK2細(xì)胞上進(jìn)行3次盲傳后，發(fā)現(xiàn)3個(gè)細(xì)胞系均出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變(圖1)。

圖1 樹(shù)鼩糞便T28致3種細(xì)胞病變效應(yīng)Fig.1 Cytopathic effects of the fecal sample T28 on the three cell lines

2.2 樹(shù)鼩病毒的電鏡檢查

為了確定細(xì)胞病變是由病毒感染所致，我們收集有細(xì)胞病變的細(xì)胞上清，濃縮，磷鎢酸負(fù)染后電鏡觀(guān)察病毒粒子形態(tài)。如圖2A所示，病毒粒子呈輪狀，具有雙層衣殼結(jié)構(gòu)，直徑約為70 nm，具有呼腸孤病毒科的形態(tài)特征。感染了病毒的細(xì)胞電鏡檢查結(jié)果表明病毒主要在胞質(zhì)內(nèi)大量增殖(圖2B)。

2.3 輪狀病毒檢測(cè)

A群輪狀病毒是臨床引起腹瀉的一種主要輪狀病毒，而該病毒在形態(tài)和大小上與MRV非常相似。因此，我們用A群輪狀病毒特異性的試劑盒檢測(cè)有病變的細(xì)胞上清。結(jié)果顯示A型輪狀病毒陰性。

2.4 病毒RNA電泳及硝酸銀染色

呼腸孤病毒科的病毒基因組為分節(jié)段RNA，該家族成員的基因組RNA經(jīng)PAGE電泳后，呈現(xiàn)出特異性的條帶模式。因此，我們用RNA電泳的方法對(duì)分離到的病毒進(jìn)一步鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種細(xì)胞分離到的病毒RNA都呈現(xiàn)出哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒基因組3個(gè)L節(jié)段，3個(gè)M節(jié)段和4個(gè)S節(jié)段的特征性模式(見(jiàn)圖3A)。然而，我們發(fā)現(xiàn)，從3個(gè)細(xì)胞系中分離到的病毒基因組RNA的短片段S的S1節(jié)段表現(xiàn)出2種不同的遷移率，LLC－MK2和Vero細(xì)胞上擴(kuò)增到的病毒S1節(jié)段遷移率較KMB17細(xì)胞上的病毒的快，這暗示該樹(shù)鼩糞便樣品中可能存在2種不同基因型的正呼腸孤病毒。

注:A.培養(yǎng)上清負(fù)染(1 cm=100 nm);B.細(xì)胞超薄切片(1 cm=2 μm)。圖2 病毒感染的KMB17細(xì)胞及其培養(yǎng)上清透射電鏡Note.A.Culture supernatant by negative staining，scale bar 1 cm=100 nm;B.Ultra－thin section of infected KMB17 cells，scale bar 1 cm=2 μm.Fig.2 The viral particles in culture supernatant and in the cytoplasm of infected KMB17 cells revealed by transmission electron microscopy

2.5 病毒S1全長(zhǎng)基因RT-PCR擴(kuò)增

為了進(jìn)一步確定分離到的病毒的基因型，根據(jù)已報(bào)道的型特異性S1基因節(jié)段序列設(shè)計(jì)了分別針對(duì)I、II和III型病毒的特異性引物，對(duì)病毒基因組RNA進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有I和III型特異性引物能擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，未見(jiàn)II引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物(圖3B)。與RNA的電泳結(jié)果類(lèi)似，LLC－MK2和Vero細(xì)胞上擴(kuò)增到的病毒RNA只有Ⅲ型引物能擴(kuò)增得到預(yù)期大小的目的片段，且二者的大小一致;而KMB17細(xì)胞上擴(kuò)增得到的病毒RNA只有I型引物能擴(kuò)增得到預(yù)期大小的片段(圖3B)。這一結(jié)果不僅表明了我們從樹(shù)鼩中分離到了呼腸孤病毒，而且可能存在2種不同基因型。

2.6 樹(shù)鼩呼腸病毒S1全長(zhǎng)基因序列分析

為進(jìn)一步研究分離到的樹(shù)鼩呼腸孤病毒與已報(bào)道的呼腸孤病毒之間的遺傳關(guān)系，我們對(duì)擴(kuò)增得到的S1全長(zhǎng)基因進(jìn)行克隆、測(cè)序和序列分析。結(jié)果表明，KMB17培養(yǎng)上清中，通過(guò)I型引物能擴(kuò)增得到全長(zhǎng)1463 bp的血清型別特異性S1基因片段，比對(duì)結(jié)果表明，該序列與GenBank中哺乳動(dòng)物呼腸病毒I型原型株T1L(EF494445)同源性最高，核苷酸序列同源性為85%，氨基酸序列同源性為90%，因此將該病毒定型為樹(shù)鼩呼腸孤病毒I型，命名T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013 (GenBank，登 錄 號(hào)KP185123)。LLC－MK2和Vero細(xì)胞上清中的病毒，通過(guò)III型引物能擴(kuò)增得到1416 bp的S1全長(zhǎng)基因，比對(duì)結(jié)果表明，這兩株適應(yīng)培養(yǎng)病毒S1基因完全同源，與GenBank庫(kù)中哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒Ⅲ型原型株T3D(HM159619)核苷酸同源性為85%，氨基酸同源性為92%，因此該病毒定型為樹(shù)鼩呼腸孤病毒III型，分別命名 T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013(Gen－Bank，登錄號(hào) KP185124)和 T3/T28－3/Tupaia/Kunming/2013(GenBank，登錄號(hào) KP185124)。

注:A.病毒基因組RNA聚丙烯酰胺凝膠電泳;B.病毒基因組S1片段RT－PCR分析。圖3 樹(shù)鼩糞便樣品T28細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒基因組分析Note.A.RNA PAGE analysis of viral genomes;B.RT－PCR analysis of genomic S1 fragment of virusesFig.3 Genomic analysis of viruses in the supernatant of Tupaia fecal sample T28－inoculated cells.

采用Maximum Likelihood方法，對(duì)本研究獲得的2株病毒的S1節(jié)段基因序列分別與GenBank中具有全長(zhǎng)S1基因序列的哺乳動(dòng)物呼腸病毒I型和III型病毒進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，我們分離到的I型病毒株T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013單獨(dú)成簇，與T1L原型株和中國(guó)2011年雪貂分離株的關(guān)系較近，而與2011年中國(guó)豬源分離株SHR－A遺傳距離相對(duì)遠(yuǎn)一些(圖4A)。III型病毒S1基因片段可以明顯地分2個(gè)大組，第一組(GI)分別由美國(guó)分離株(GIa)和亞洲分離株(GIb)組成，第二組(GII)的病毒全部來(lái)自歐洲。我們分離到的III型病毒株T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013雖然與亞洲的其他分離株形成了明顯的一簇，但它也單獨(dú)形成一個(gè)進(jìn)化分支(圖4B)。這些結(jié)果表明我們分離到的2株不同基因型的MRV均已進(jìn)化適應(yīng)了樹(shù)鼩宿主。

注:A.I型病毒;B.III型病毒;代表本研究的分離株。圖4 呼腸病毒S1基因全長(zhǎng)核苷酸序列的種系進(jìn)化分析Note.A.Serotype I;B.Serotype III;Represents viruses isolated in this study.Fig.4 Phylogenetic trees based on full length of S1 nucleotide sequences of mammalian orthoreovirus

3 討論

本研究通過(guò) KMB17、Vero和 LLC－MK2三種不同的細(xì)胞系對(duì)一個(gè)腹瀉樹(shù)鼩的糞便樣品進(jìn)行病毒分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)細(xì)胞均表現(xiàn)不同程度的細(xì)胞病變。經(jīng)透射電子顯微鏡觀(guān)察、病毒基因組RNA PAGE電泳和病毒基因組S1片段的序列分析，證實(shí)我們從腹瀉樹(shù)鼩的糞便樣品中分離到的是I型和III型哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒。

細(xì)胞是病毒分離的常用工具，不同的細(xì)胞適合分離不同類(lèi)型的病毒。Vero細(xì)胞適于多種病毒的分離，包括:正呼腸孤病毒、輪狀病毒、腸道病毒等。另外，同一病毒在不同細(xì)胞中復(fù)制情況可能不一樣。以前報(bào)道顯示通過(guò)Vero細(xì)胞從樹(shù)鼩糞便樣品中分離到正呼腸孤病毒［21］。多種病毒可以引起腹瀉性疾病，為了弄清可能引起樹(shù)鼩腹瀉的病毒，我們采用了3個(gè)常用于病毒分離的細(xì)胞系KMB17、Vero和LLC－MK2對(duì)糞便樣品里的病毒進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定，發(fā)現(xiàn)了2種基因型正呼腸孤病毒存在于樹(shù)鼩的腹瀉樣品中，其中I型分離株T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013能在KBM17細(xì)胞上適應(yīng)增殖，而III型分離株T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013則能在 Vero、LLC－MK2細(xì)胞上適應(yīng)增殖。KMB17細(xì)胞為人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞，而Vero細(xì)胞為非洲綠猴腎上皮細(xì)胞，LLC－MK2為獼猴腎上皮細(xì)胞，這對(duì)以后通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行哺乳動(dòng)物呼腸病毒分離鑒定和選用適宜的細(xì)胞具有指導(dǎo)借鑒意義。

血清中和試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)是對(duì)哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒I型、II型和III型進(jìn)行血清型別鑒定的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法。我們參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了哺乳動(dòng)物呼腸病毒型特異性抗原的編碼基因S1片段全長(zhǎng)，并通過(guò)克隆、測(cè)序及核苷酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)我們分離到的病毒株為哺乳動(dòng)物呼腸孤I型和III型病毒。因?yàn)镾1蛋白是唯一一個(gè)與病毒血清型特異性有關(guān)的蛋白［9－11］，所以本研究 RT－PCR 方法對(duì)于樹(shù)鼩MRV的血清型鑒定起非常重要的作用。

S1基因片段有2個(gè) ORFs，編碼黏附蛋白 σ1和非結(jié)構(gòu)蛋白 σ1s。σ1蛋白呈纖維狀，其球狀頭部有兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞表面受體結(jié)合區(qū)域，分別為連接粘附分子結(jié)合域和唾液酸分子結(jié)合域［23］。σ1蛋白是病毒黏附蛋白，介導(dǎo)病毒對(duì)宿主細(xì)胞的入侵。σ1蛋白的這兩個(gè)結(jié)合域，在不同毒株之間的分布和結(jié)構(gòu)不同。本實(shí)驗(yàn)研究中，I型毒株與III型毒株之間σ1蛋白氨基酸同源性?xún)H為27%，而 I型毒株在KMB17人二倍體成纖維細(xì)胞上有選擇性的適應(yīng)生長(zhǎng)，III型毒株則在Vero、LLC－MK2猴腎上皮細(xì)胞上適應(yīng)生長(zhǎng)，可能與它們的S1基因所編碼的σ1病毒黏附蛋白的結(jié)構(gòu)及細(xì)胞表面受體特征有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

呼腸孤病毒S1基因片段與病毒的血清型密切相關(guān)，本研究通過(guò)BLAST找到了12株已知的I型病毒S1基因全長(zhǎng)序列，分析發(fā)現(xiàn)我們的分離株與我國(guó)最近報(bào)道從雪貂分離到的3株病毒以及T1L型原型株關(guān)系較近，而與中國(guó)的豬分離株關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)一些。然而由于I型病毒的S1基因片段序列的數(shù)目較少，不能發(fā)現(xiàn)各個(gè)分離株之間明顯的關(guān)系。

綜上所述，本研究首次通過(guò)多種細(xì)胞對(duì)腹瀉樹(shù)鼩的糞便樣品進(jìn)行病毒的分離和鑒定，并且同時(shí)獲得了I型和III型的正呼腸孤病毒，這些結(jié)果一方面為診斷樹(shù)鼩的腹瀉提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，然而確定哪型病毒與樹(shù)鼩的腹瀉有關(guān)，還需要更深入的研究，另一方面對(duì)于將來(lái)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)分離鑒定正呼腸孤病毒時(shí)細(xì)胞的選擇有很好的指導(dǎo)作用。

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