石海濤 張傳領

血管性癡呆患者p38MAPK通路變化及參茸養(yǎng)心益腎膠囊干預作用

石海濤 張傳領

目的 觀察參茸養(yǎng)心益腎膠囊對血管性癡呆（AD）患者腦脊液和外周血p38MAPK通路主要因子P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達的影響。方法 血管性癡呆患者31例為病例組，給予參茸養(yǎng)心益腎膠囊治療，對比治療前后簡易智能量表（MMSE）評分和長谷川癡呆量表（HDS）評分變化；治療前后以Western blot檢測患者腦脊液和空腹靜脈血P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達量。以同期入院的26例非癡呆患者為對照組，進行對比分析。結果 病例組治療前MMSE、HDS評分分別為（21.3±3.5）分、（19.6±3.4）分，治療后分別上升至（28.2±4.8）分、（24.3±4.2）分，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。治療前病例組腦脊液、血P-p38MAPK/p38MAPK表達水平為（0.983±0.106）、（0.867± 0.113），明顯高于對照組的（0.248±0.042）及（0.336±0.146）（P＜0.01）；治療后病例組P-p38MAPK蛋白表達量明顯降低，P-p38MAPK/p38MAPK表達水平顯著低于治療前（P＜0.05）。結論 參茸養(yǎng)心益腎膠囊可能通過抑制血管性癡呆患者p38MAPK磷酸化激活，干預p38MAPK信號通路級聯(lián)反應而獲得臨床療效。

血管性癡呆；p38MAPK通路；益腎活血；參茸養(yǎng)心益腎膠囊

血管性癡呆（vascular dementia，VD）泛指由腦血管因素而導致的腦組織損害和智能障礙，臨床以記憶、認知、邏輯思維等精神功能衰退為主要表現(xiàn)，多發(fā)于老年人。研究[1-2]表明，內皮細胞損傷是血管性疾病的始動因素，而且其病理學機制貫穿于血管性疾病的發(fā)病全程。自p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）通路與機體內皮系統(tǒng)損傷的關系被揭示以來，其生理學功能在VD發(fā)病過程中的介導作用受到重視。動物實驗[3-4]也已經證實，VD大鼠、小鼠的海馬p38MAPK蛋白表達水平明顯上調，且其含量變化與模型鼠的記憶能力密切相關。本研究觀察31例VD患者的腦脊液和外周血p38MAPK通路活化狀態(tài)及中成藥參茸養(yǎng)心益腎膠囊對該通路的調控作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年2月—2013年6月本院神經內科收治老年VD患者31例為病例組，男19例，女12例；年齡56～81歲，平均（71.3±6.3）歲；病程1～11年，平均（5.3±0.7）年。納入標準：①符合田金洲2000版中醫(yī)辨證量表診斷及辨證標準[5]；②同時符合NINDS-ADRDA診斷標準[6]；③MMSE＜27分。排除標準：①假性抑郁性癡呆或重度癡呆；②神經精神類疾病；③癲癇；④帕金森氏??；⑤腫瘤或癌癥；⑥免疫、血液系統(tǒng)疾??；⑦機體重要器官器質性損傷等。另以同期收治的非癡呆患者26例為對照組，其中男15例，女11例；年齡55～78歲，平均（70.6±5.7）歲；慢性阻塞性肺病5例，高血壓7例,冠心病14例。研究對象均簽署知情同意書，研究經本院倫理委員會批準同意。

1.2 主要儀器和試劑 高速低溫離心機（CTechcomp，T15RT）；蛋白印跡轉移裝置（SDS-PAGE TY0736，美國伯樂公司）；振蕩培育箱（LRH-250-2，廣東醫(yī)療器械廠）；預染蛋白marker（26681，Pierce）；Tween20（P9416，Sigma）；一抗Anti-phospho-p38 MAPK（pThr 179+Tyr181）antibody（SAB4504095，Sigma）；一抗Anti-p38 MAPK antibody（SAB4500493，Sigma）；一抗Anti-actin antibody（A2066，Sigma）；二抗Anti-Rabbit IgG-Tracy 645（05557，Sigma）；其他Western blot常規(guī)試劑如RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、TEMED、ECL化學發(fā)光顯色液等均由碧云天生物技術研究所提供。

1.3 研究方法 病例組入院后予參茸養(yǎng)心益腎膠囊（規(guī)格：0.4g/粒）1次4粒，1天3次。4周為1個療程，共治療2個療程，于治療前后取腦脊液和靜脈血。對照組于入院時取腦脊液和外周血。所得腦脊液和靜脈血以RIPA裂解液（含1.0%PMSF）抽提蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。濃度確立后配置為1μg/ μL的buffer液。以10μL為上樣量進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件：80V 25min，100V 80min，使不同分子量的蛋白條帶分離。麗春紅染液檢測分離條帶清晰、完整，轉印至NC膜，轉印條件：100V 1h。轉印的NC膜先行一抗孵育，4℃震蕩搖勻過夜，P-p38 MAPK、p38 MAPK、β-actin均溶于4%的脫脂牛奶，抗體濃度分別為1:2500、1:2000、1：3000。PBS液清洗3～5次，二抗孵育，抗體濃度均為1: 2000，28℃ 90min。二抗孵育完畢進行顯影，顯影條帶掃描成像，以灰度分析軟件分析灰度值，目的條帶和β-actin比值為最終相對表達量。

1.4 觀察指標 病例組治療前后應用簡易精神狀態(tài)檢查表（MMSE）、長谷川癡呆量表（HDS）進行評分[7]；兩組P-p38MAPK/p38MAPK表達水平測定。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s） 表示，治療前組間對比采用兩獨立分組t檢驗，病例組治療前后采用配對設計t檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 治療前后MMSE和HDS評分 病例組治療后MMSE和HDS評分均有所提高，與治療前比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 VD患者治療前后MMSE和HDS評分比較（分，±s）

表1 VD患者治療前后MMSE和HDS評分比較（分，±s）

治療前治療后t，P 31 31 -21.3±3.5 28.2±4.8 6.221，0.000 19.6±3.4 24.3±4.2 4.652，0.000

2.2 兩組P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達比較 治療前，病例組外周血、腦脊液P-p38MAPK蛋白表達量偏高，P-p38MAPK/p38MAPK表達水平明顯高于對照組（P＜0.01）；治療后病例組外周血、腦脊液P-p38MAPK蛋白表達量明顯降低，P-p38MAPK/ p38MAPK表達水平顯著低于治療前（P＜0.01）；見表2～3、圖1。

3 討論

VD的發(fā)病機制尚未完全明確，內皮系統(tǒng)損傷為其重要突破口之一。內皮細胞激活是發(fā)生內皮系統(tǒng)損傷的始動因素，炎癥介質、應激刺激、病原體感染、細菌內毒素等病理因素均可構成其激活條件，激活后又可持續(xù)釋放多種黏附分子、炎性介質及活性物質，誘發(fā)進一步的炎癥反應和細胞凋亡[7]。p38MAPK信號通路由一組以級聯(lián)方式依次活化的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，MAPK激酶激酶、MAPK激酶及MAPK通過磷酸化依次將上游信號傳遞至下游應答分子，故而p38MAPK磷酸化為該通路活化的重要標志之一，即P-p38MAPK為p38MAPK的活化狀態(tài)。劉倩等[8]對p38MAPK信號通路與內皮系統(tǒng)損傷的相關性做了闡述，指出p38MAPK通路活化是啟動內皮系統(tǒng)損傷的先決條件，在血管性疾病中發(fā)揮了誘導、催化和促進級聯(lián)化的病理功能。

表2 兩組腦脊液P-p38MAPK/p38MAPK表達水平（±s）

表2 兩組腦脊液P-p38MAPK/p38MAPK表達水平（±s）

注：“t1，P1”表示病例組治療前與對照組比較，“t2，P2”表示病例組治療前與治療后比較

組別對照組病例組治療前治療后例數(shù)26 31 31 t1，P1t2，P2--P-p38MAPK 0.135±0.084 0.517±0.121 0.246±0.095 14.02，0.000 9.471，0.000 p38MAPK 0.543±0.102 0.526±0.084 0.534±0.093 0.678，0.250 0.338，0.368 P-p38MAPK/p38MAPK 0.248±0.042 0.983±0.106 0.461±0.063 35.47，0.000 23.02，0.000

表3 兩組外周血P-p38MAPK/p38MAPK表達水平比較（±s）

表3 兩組外周血P-p38MAPK/p38MAPK表達水平比較（±s）

注：“t1，P1”表示病例組治療前與對照組比較，“t2，P2”表示病例組治療前與治療后比較

對照組病例組治療前治療后26 31 31 t1，P1t2，P2--0.203±0.146 0.465±0.187 0.312±0.162 6.639，0.000 4.543，0.000 0.554±0.281 0.536±0.275 0.549±0.277 0.243，0.404 0.177，0.430 0.336±0.146 0.867±0.113 0.568±0.185 11.12，0.000 5.672，0.000

圖1 病例組P-p38MAPK、p38MAPK表達W estern blot顯影圖像注：①A腦脊液，B外周血；②1、2對照組腦脊液，3、4病例組治療前腦脊液，5、6病例組治療后腦脊液

中藥治療VD的臨床療效已被諸多實驗證實[9-10]，本研究中所用參茸養(yǎng)心益腎膠囊藥物組成為鹿茸、人參、酒制菟絲子、肉蓯蓉、何首烏、桑葚及黃精等，藥理研究[11-12]表明，鹿茸含有雄性激素、卵泡激素及多種微量元素，可改善能量代謝、促進生長發(fā)育，具有強筋骨、抗疲勞之效。適量的鹿茸還能夠增加心輸出量和血氧量、改善血液循環(huán)，同時提高副交感神經的興奮性，促進受損神經功能恢復，是治療血管性疾病的良品。人參性溫，為中醫(yī)常用補益藥，具有擴血管作用，可改善微循環(huán)，調節(jié)中樞神經系統(tǒng)興奮性，提高學習記憶能力。方中鹿茸、人參共為君藥；菟絲子補肝腎、益精髓，肉蓯蓉與何首烏補腎陽、益精血，共為臣藥；桑葚既可入食，又可入藥，可養(yǎng)心益智、補血活血，為佐藥；黃精補氣養(yǎng)陰，健脾潤肺，為佐使；諸藥合用，共司養(yǎng)血活血、益腎安心之效。本研究結果顯示，治療前病例組P-p38MAPK蛋白表達量偏高，P-p38MAPK/p38MAPK表達水平明顯高于對照組；治療后，病例組P-p38MAPK蛋白表達量明顯降低，P-p38MAPK/p38MAPK表達水平顯著低于治療前，且病例組患者MMSE、HDS評分亦有顯著提升，說明老年VD患者的p38MAPK通路確實處于異常活化狀態(tài)，而益腎活血方藥可抑制其活化，提高患者認知能力。

綜上所述，老年VD的發(fā)病過程中伴隨著p38 MAPK通路的活化，參茸養(yǎng)心益腎膠囊能夠通過下調P-p38MAPK水平抑制其活化過程，從而中斷p38MAPK信號通路級聯(lián)反應，可能為其治療VD的重要藥理機制之一。

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（收稿：2014-11-16 修回：2015-01-26）

p38MAPK Pathway Changes in Patients w ith Vascular Dementia and the Effect of Ginseng Nourishing the Heart and K idney CapsuleIntervention

SHI Haitao1,ZHANG Chuanling2. 1Department of Neurology,2Clinical Laboratory,Xiaoshan Hospital,Hangzhou(311201),China

Objective To investigate the effect of ginseng yangxin yishen capsule on P-p38MAPK/p38MAPK protein expression in cerebrospinal fluid and peripheral blood from patients with vascular dementia.M ethods Thirty-one patients with vascular dementia were recruited as case group and were given ginseng yangxin yishen capsules.Mino-mental State Examination（MMSE）and Hasegawa Dementia（HDS）scores were evaluated and compared before and after treatment.P-p38MAPK/p38MAPK protein expression in cerebrospinal fluid and peripheral blood were detected by Western blot.Twenty-six non-vascular dementia patients over the same period served as control.Results In case group,the MMSE and HDS scores increased to 28.2±4.82 and 24.3±4.19 from 21.3±3.54 and 19.6±3.44,respectively,both with significant difference before and after treatment（P＜0.05）.Before treatment, P-p38MAPK/p38MAPK protein expressions in cerebrospinal fluid and peripheral blood in case group were higher than those in control group（cerebrospinal:0.983±0.106 vs 0.248±0.042，P＜0.05;peripheral blood:0.867±0.113 vs 0.336±0.146,P＜0.05）;after treatment,the expression of P-p38MAPK protein and P-p38MAPK/p38MAPK level in case group significantly decreased compared with those before treatment（P＜0.05）.Conclusion Ginseng yangxin yisheng capsule may treat vascular dementia by interfering p38MAPK signal pathway via inhibiting activation of P-p38MAPK.

vascular dementia;p38MAPK signal pathway;yishen huoxue;Ginseng yangxin yisheng capsule

杭州市蕭山醫(yī)院神經內科（石海濤）、檢驗科（張傳領）（杭州 311201）

石海濤，Tel：18967168116；E-mail：ll_141005@sina.com