宋 錦，彭卓玲，吳 斌，梁海英 (廣東省湛江市第三人民醫(yī)院，廣東 湛江 524012)

ELISA 法檢測是目前實(shí)驗(yàn)室生化檢測的常用方法之一，在臨床應(yīng)用較為廣泛。但ELISA 實(shí)驗(yàn)中各個(gè)操作環(huán)節(jié)均可對試驗(yàn)結(jié)果造成影響，進(jìn)而出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，其主要影響因素包括血液樣本發(fā)生溶血、脂血及細(xì)菌污染、離心時(shí)間及離心轉(zhuǎn)速、標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)試劑加樣不準(zhǔn)確，以及溫度及溫育、洗板、顯色時(shí)間及溫度等［1］。其中，不同溫度及溫育是實(shí)際操作中影響結(jié)果的重要因素之一。我們對不同溫度及溫育條件下ELISA法測定HbsAg 的陽性結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選擇2014 年1 月～2014 年5 月我院住院患者HbsAg 陽性標(biāo)本60 份，分離血清后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法:采用DR-200BS 酶標(biāo)儀、DRW-320 洗板機(jī)、HHW21-600BS 型數(shù)顯恒溫水浴鍋等設(shè)備及儀器，另外HBsAg ELISA 試劑盒由上海榮盛生物藥業(yè)有限公司提供，HBsAg 標(biāo)準(zhǔn)品廣東省臨檢中心提供。檢測時(shí)首先調(diào)節(jié)室溫至25℃，從冷藏環(huán)境中取出試劑盒，在室溫下平衡30 min，同時(shí)將濃縮洗滌液作1∶20 稀釋，分別采用兩種不同溫度及溫育時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察組標(biāo)本采用37℃分別孵育10 min、20 min 及30 min，對照組采用25℃分別溫育10 min、20 min 及30 min。試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟進(jìn)行操作，每個(gè)樣本反復(fù)檢測4 次，每次置于5 微孔平行檢測，同時(shí)設(shè)空白對照孔一孔，陰性對照、陽性孔各兩孔。具體步驟如下:平衡，從-20℃冰箱中取出待測血清及2 ～8℃冷藏環(huán)境中取出檢測試劑盒，置于室溫中30 min 待用;配液，用蒸餾水或去離子水將濃縮洗滌液作1∶20 稀釋待用;加樣，分別取待檢樣品加入各孔中，其中陰性對照組、陽性對照組及室內(nèi)質(zhì)控品各取50 μl;加酶，取酶標(biāo)試劑50 μl 加入各孔中;溫育，用封板膜妥善封板后置于不同的溫育溫度下孵育不同的時(shí)間;洗滌;取出封板膜后用洗板機(jī)洗滌酶標(biāo)板5 次至扣干;顯色，將顯色劑A、B 各50 μl 加入各孔，不同溫度條件下避光顯色15 min;測定，將終止液50 μl 加入各孔，采用酶標(biāo)儀:檢測波長450 nm，參考波長630nm，測定各樣品的OD 值。讀數(shù)須在終止液反應(yīng)后10 分鐘內(nèi)完成。陰性對照平均值小于0.1，陽性對照平均值大于1.2。Cutoff 值計(jì)算:Cov=陰性對照平均值OD 值×2.1，比較兩組不同溫育條件下樣本的陽性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS12.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組陽性檢測結(jié)果比較:觀察組孵育10 min、孵育20 min、孵育30 min 的陽性率與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 兩組陽性例數(shù)檢測結(jié)果比較［例(%)］

2.2 兩組OD 值均值比較:觀察組孵育30 min 時(shí)OD 值明顯高于對照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 兩組OD 值均值比較

表2 兩組OD 值均值比較

注:與對照組比較，①P ＜0.05

組別 例數(shù) 孵時(shí)育O1D0 值min孵時(shí)育O2D0 值min孵時(shí)育O3D0 值min觀察組30 1.81±0.24 2.11±0.22 2.45±0.21①對照組30 1.65±0.21 1.95±0.23 2.13±0.33 P 值0.250 0 0.310 8 0.031 2

3 討論

乙肝表面抗原(HbsAg)為乙肝病毒的外殼蛋白物質(zhì)，廣泛存在于患者的血液、陰道分泌物、精液、唾液、乳汁、淚液、汗液以及鼻咽分泌物等體液中，是臨床檢測已感染乙肝病毒的重要標(biāo)志之一。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在臨床應(yīng)用較為廣泛，是感染性疾病目前常用的血清學(xué)標(biāo)志物免疫測定方法之一，也是免疫學(xué)及分子生物學(xué)當(dāng)中最為中重要的方法之一，具有簡便、快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高以及可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該檢測方法對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及儀器要求低，不存在放射性污染，因此在臨床廣泛應(yīng)用［2］。盡管ELISA 操作過程簡便，原理簡潔，但在實(shí)際臨床實(shí)驗(yàn)室工作中，經(jīng)常出現(xiàn)不同操作者得到的不同測定結(jié)果的情況，除了由于操作者對整個(gè)測定過程沒有進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、操作細(xì)節(jié)出現(xiàn)偏差等因素對測定結(jié)果影響之外，溫育溫度和溫育時(shí)間是影響檢測結(jié)果不可忽視的因素之一。

我們對不同溫度及溫育條件下ELISA 法測定HbsAg 的陽性結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)研究，觀察組孵育10 min、孵育20 min、孵育30 min 的陽性率與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);觀察組孵育30 min 時(shí)OD 值明顯高于對照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);提示兩組不同條件下檢出率基本一致，而37℃孵育30 min 的檢出率略優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)條件，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。試驗(yàn)顯示，在同一孵育溫度下，反應(yīng)時(shí)間在10 ～30 min 內(nèi)其OD 值與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系，即反應(yīng)時(shí)間越長，則OD 值越大。以上研究結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)設(shè)備及儀器、試劑、操作、離心時(shí)間及離心轉(zhuǎn)速、洗板、顯色時(shí)間均一致的條件下，37℃孵育30 min OD 值高于25℃反應(yīng)條件，檢出率隨之升高。為進(jìn)一步提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在采用37℃孵育30 min反應(yīng)的前提下，仍需要做好以下幾點(diǎn):首先嚴(yán)格選擇試劑，保證試劑的質(zhì)量，購買時(shí)嚴(yán)把三證齊全的關(guān)卡，禁止使用過期的試劑;試劑盒必須置于室溫平衡30 min 后方可使用。同時(shí)，注意保持標(biāo)本的新鮮性，最好是當(dāng)天采集的標(biāo)本當(dāng)天進(jìn)行檢測［3］;若標(biāo)本采集后如無法進(jìn)行及時(shí)檢測則需分離血清置于-20℃以下保存?zhèn)溆?，?yán)禁反復(fù)凍融。嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度，溫育中應(yīng)封閉樣本，防止邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生。洗板時(shí)需徹底，但切忌過度洗板，防止抗原抗體復(fù)合物脫掉;顯色時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按操作時(shí)間，每批測試均需做室內(nèi)質(zhì)控，同時(shí)要建立完善審核制度［4］?？傊?7℃孵育30 min OD 值高于25℃反應(yīng)條件，檢出率高，值得推薦，同時(shí)配合嚴(yán)格的操作細(xì)節(jié)，保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

［1］ 李金明.臨床酶免疫測定技術(shù)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2005:87-90.

［2］ 葛君琍，王麗娜.不同溫育方式對ELISA 法檢測HbsAg結(jié)果的影響［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34(2):194.

［3］ 郭 翀，張真銘.ELISA 法檢測HBsAg 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32(6):656.

［4］ 劉 婷.3 種不同實(shí)驗(yàn)條件的ELISA 法檢測HBsAg 的比較研究［J］.中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10(726):48.