張 蕾 包天佑

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧，810001)

眾所周知哮喘是一種反復(fù)發(fā)作的常見(jiàn)病，而氣道重塑既是氣道炎癥反復(fù)刺激的結(jié)果［1］，又是哮喘向著不可逆發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。地塞米松作為治療哮喘炎癥有效制劑，在延緩氣道重塑方面也有一定作用［2］，但由于長(zhǎng)期應(yīng)用可以造成患者對(duì)此藥敏感度降低以及服用西藥本身的不良反應(yīng)，故研制中藥治療哮喘迫在眉睫。麻杏二三湯作為焦樹(shù)德大師的代表方劑在臨床上治療慢性哮喘急性發(fā)作有明顯的作用［3］，本課題即是通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)探索麻杏二三湯對(duì)哮喘氣道重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 將50只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(200±20)g(甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):62001000000019，許可證號(hào):SCXK(甘)2011-0001)在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行隨機(jī)分組:空白組(A組)、模型組(B組)、麻杏二三湯組(C組)、地塞米松組(D組)，每組共10只。

1.2 藥物 麻杏二三湯(炙麻黃、杏仁、化橘紅、半夏、茯苓、炒蘇子、萊菔子、白芥子、訶子、甘草、枇杷葉、茉莉花茶，青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)門(mén)診部)，使用前將一劑(總重100 g)文火煎煮后濃縮成1 g/mL。醋酸地塞米松片(天津d藥藥業(yè)股份有限公司)，研磨于水，濃度為1 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器 雞卵清蛋白(OVA)(美國(guó)Sigma公司分裝);氫氧化鋁干粉(天津化學(xué)試劑三廠，分析純);大鼠ELLSA轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β1試劑盒、大鼠ELLSA內(nèi)皮素-1試劑盒(北京科博信生物技術(shù)有限公司);透明不完全封閉染毒缸(直徑40 cm，高45 cm);ZH-E11超聲霧化器(江蘇江航醫(yī)療設(shè)備有限公司);RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。

1.4 模型制備及藥物干預(yù) 參照文獻(xiàn)［4-6］并加以改良，制作哮喘大鼠早期氣道重塑模型。除空白組外，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1天、第8天、第15天將配好的致敏液1 mL(含有OVA 10 mg，氫氧化鋁干粉200 mg)分多點(diǎn)注射于其余各組大鼠:大鼠雙側(cè)腹股溝、腹部、一側(cè)前足趾共4點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)0.2 mL，同時(shí)腹腔注射0.2 mL。第16天時(shí)將大鼠放入染毒缸內(nèi)，每次放5只，除A組外用生理鹽水霧化，其余各組用2%OVA霧化吸入，1次/d，每次30 min，連續(xù)激發(fā)20 d。各組霧化30 min前每只大鼠給予藥物灌胃干預(yù):A組生理鹽水20 mL/kg;B組生理鹽水20 mL/kg;C組麻杏二三湯15 mL/kg+生理鹽水5 mL/kg;D組地塞米松1 mL/kg+生理鹽水15 mL/kg。激發(fā)后第一天，模型組可見(jiàn)大鼠煩躁、咳嗽、打噴嚏或行動(dòng)遲緩、等癥狀。并從模型組隨機(jī)抽取一只處死，迅速取下右支氣管肺組織浸泡于4%多聚甲醛固定72 h并做病理切片，光鏡下觀察到支氣管和肺泡壁有多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，即哮喘發(fā)作激發(fā)成功。其余全部各組于末次激發(fā)后全部處死，全肺取出稱(chēng)重，左肺迅速置于液氮中備用，右肺浸泡于4%多聚甲醛固定72 h。

1.5 檢測(cè)各種指標(biāo)

1.5.1 建造早期哮喘氣道重塑模型成功指標(biāo) 1)動(dòng)物行為改變:每次哮喘激發(fā)過(guò)程中，大鼠煩躁不安、頻繁咳嗽打噴嚏或行動(dòng)遲緩、俯仰不動(dòng)、二便失禁、仰背式呼吸甚則發(fā)紺。2)生理指標(biāo):大鼠體重顯著下降，肺系數(shù)明顯升高。3)病理學(xué)指標(biāo):將浸泡于甲醛的肺右葉脫水、包埋、切片，HE染色。并用NYD1000型圖像分析軟件截取完整的支氣管測(cè)定管腔的內(nèi)周長(zhǎng)(Pbm)、支氣管壁總面積(Wat)、支氣管平滑肌面積(Wam)，并用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化，即分別以支氣管厚度=Wat/Pbm和平滑肌厚度=Wam/Pbm來(lái)衡量氣道重塑程度。造模成功顯示與空白組比支氣管壁厚度和氣道平滑肌明顯增厚。

1.5.2 肺組織TGF-β1和ET-1的檢測(cè) 取同等重量的左肺組織加等滲鹽水勻漿、離心，取其上清液，采用ELLSA法測(cè)定TGF-β1、ET-1表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPASS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以(ˉx±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重和肺系數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重?zé)o顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)后各組大鼠體重均不同程度增長(zhǎng)，但各組之間存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(模型組大鼠在哮喘發(fā)作過(guò)程中死亡2只，不排除灌胃操作不當(dāng)致死的可能性)，模型組大鼠體重大于空白組、肺系數(shù)小于空白組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);麻杏二三湯組體重大于地塞米松組、肺系數(shù)小于地塞米松組，并都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重(g)

表2 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠體重(g)、肺系數(shù)(%)

2.2 病理組織學(xué)變化 各組大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度增厚，以模型組尤為顯著(P＜0.05);與模型組比，兩個(gè)用藥干預(yù)組大鼠的體重較大、肺系數(shù)較低、氣管壁厚度和平滑肌厚度明顯降低(P＜0.05)，且麻杏二三湯組支氣管壁和平滑肌厚度都低于地塞米松組(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠病理學(xué)指標(biāo)(%)

2.3 肺組織TGF-β1和ET-1含量分析 與空白組比，模型組TGF-β1和ET-1含量較高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比，兩個(gè)藥物干預(yù)組 TGF-β1和ET-1含量均較低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。麻杏二三湯組TGF-β1和ET-1含量低于地塞米松組組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表4和圖1。

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1和ET-1含量(ng/L)

圖1 各組大鼠肺組織TGF-β1和ET-1含量

3 討論

近年來(lái)關(guān)于哮喘的發(fā)病機(jī)制有很多學(xué)說(shuō)，其中主要的有:氣道炎癥學(xué)說(shuō)、神經(jīng)——受體失衡學(xué)說(shuō)、免疫與變態(tài)反應(yīng)學(xué)說(shuō)。哮喘的傳統(tǒng)治法是應(yīng)用激素類(lèi)藥物對(duì)炎癥的治療，而近年多項(xiàng)研究和仍然高發(fā)的哮喘表明單純的抗炎無(wú)法徹底治療哮喘，并在哮喘患者的尸體解剖中發(fā)現(xiàn)氣道平滑肌和氣道管壁的增厚是其明顯的病理特征［7-8］，即氣道重塑。另有研究表明氣道重塑不單出現(xiàn)在重度哮喘患者上，還可在輕度哮喘和哮喘的早期被發(fā)現(xiàn)［9］，可推測(cè)氣道重塑很可能是哮喘不易根治的重要病理基礎(chǔ)，而延緩甚至阻止氣道重塑也是治療哮喘的重要方向和難解之題。本課題利用延長(zhǎng)OVA激發(fā)時(shí)間復(fù)制哮喘氣道重塑模型已得到廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用［10］，而基于哮喘發(fā)作時(shí)管腔內(nèi)周長(zhǎng)和氣道管壁面積保持不變?cè)?，分別將Wat和Wam用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化，克服了大小不同、狀態(tài)不同和切片方向不同氣管造成的誤差，所得出的比值能客觀反映氣道重塑的程度，是判斷造模效果主要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)在連續(xù)激發(fā)哮喘20 d后，模型組支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度明顯大于空白組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即早期哮喘氣道重塑造模成功。

TGF-β1是一類(lèi)多效能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞外基質(zhì)合成調(diào)節(jié)中有重要作用［11-12］，在哮喘發(fā)作過(guò)程中主要由肺及氣道的嗜酸性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞大量釋放，并表現(xiàn)在大鼠肺組織TGF-β1顯著升高，其下游信號(hào) TGF-β1/Smads活化，同時(shí)被釋放的TGF-β1反之又刺激了氣道上平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞使其細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積，構(gòu)成了氣道重塑的重要基礎(chǔ)。ET-1是機(jī)體在缺氧缺血應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種致?lián)p傷因子，它是已知最強(qiáng)烈的縮血管物質(zhì)和支氣管收縮劑，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、氣管、支氣管黏膜、平滑肌、肺血管，在體內(nèi)肺部分布最多，并且哮喘發(fā)作時(shí)氣道上皮含量是最高的，可以通過(guò)直接收縮氣道平滑肌及刺激花生四烯酸、血小板活化因子、組胺等致使多種炎癥釋放，使氣道高反應(yīng)性增高，同時(shí)使其缺血、缺氧情況更加嚴(yán)重，因此ET-1常用于檢測(cè)檢測(cè)患者哮喘嚴(yán)重程度［13］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的肺組織 TGF-β1、ET-1含量明顯升高，提示哮喘發(fā)作和氣道重塑過(guò)程中這兩個(gè)因子都有參與且成正相關(guān)。因而具有有效拮抗TGF-β1和ET-1的藥物是哮喘治療中重要的研究方向。

中醫(yī)認(rèn)為哮喘發(fā)作是人體內(nèi)環(huán)境紊亂基礎(chǔ)上加上“非時(shí)之感”，即外感六淫或煙塵、毛屑、異味、飲食不當(dāng)?shù)?。本課題用方——麻杏二三湯是我國(guó)著名中醫(yī)專(zhuān)家焦樹(shù)德的經(jīng)驗(yàn)方，該方由炙麻黃、杏仁、化橘紅、半夏、茯苓、炒蘇子、萊菔子、白芥子、訶子、甘草、枇杷葉、茉莉花茶組成。方中麻黃、杏仁歸肺經(jīng)，麻黃宣肺平喘，杏仁降氣止咳，一宣一降同為君藥;化橘紅、半夏和炒蘇子、萊菔子、白芥子(三子養(yǎng)親湯)同為臣藥，燥濕化痰、理氣消食;茯苓、訶子、茉莉花茶及甘草，健脾利水，補(bǔ)肺潤(rùn)肺共成佐使。現(xiàn)代藥理研究表明:麻黃中的有效成分麻黃堿可以間接發(fā)揮擬腎上腺素的作用、興奮支氣管α-受體和β-受體來(lái)松弛氣管平滑肌，麻黃揮發(fā)油有明顯平喘抗炎祛痰作用，同時(shí)麻黃還能調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞的比例［14］;杏仁和枇杷葉中含有的杏仁苷可以在胃中產(chǎn)生胃微量氫氰酸，促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)生成，進(jìn)而減少炎性滲出，同時(shí)對(duì)呼吸中樞有鎮(zhèn)靜作用以達(dá)到平喘效果［15-16］;半夏含有生物堿、有機(jī)酸等多種成分，其中總游離有機(jī)酸有明顯的鎮(zhèn)咳祛痰功效［17］;麻黃、杏仁、半夏三藥合用能夠降低哮喘患者白介素4、一氧化氮、免疫球蛋白E水平，從而抑制氣道炎癥和延緩氣道重塑［18］;炒蘇子、萊菔子、白芥子均可行痰化痰、降氣平喘，對(duì)非特異性炎癥的抑制作用較好［19］;茯苓和化橘紅提取物具有抗菌、抗炎、抗病毒作用［20］。諸藥合用，共奏化痰蠲飲、降氣平喘之功。

總結(jié)本次試驗(yàn)結(jié)果:1)與實(shí)驗(yàn)前相比，實(shí)驗(yàn)后各組大鼠體重均有增長(zhǎng)，但各組之間體重和肺系數(shù)仍存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:兩個(gè)藥物干預(yù)組的大鼠體重較模型組體重?cái)?shù)值升高、肺系數(shù)降低，且有意義;麻杏二三湯組的大鼠肺系數(shù)小于地塞米松組，且有意義。臟器系數(shù)可以客觀的表現(xiàn)藥物對(duì)該臟器的毒性作用［21］，因此該實(shí)驗(yàn)提示地塞米松的應(yīng)用仍存在不良反應(yīng)，長(zhǎng)期臨床用藥及哮喘緩解期可以單用麻杏二三湯。2)與模型組比較，兩個(gè)用藥干預(yù)組氣道管壁和平滑肌厚度、TGF-β1和ET-1含量都有降低，且有臨床意義，表明兩種用藥方法都對(duì)延緩氣道重塑方面有一定作用;麻杏二三湯組的氣道管壁和平滑肌厚度降低效果優(yōu)于地塞米松組。但在哮喘發(fā)作過(guò)程中麻杏二三湯如何降低TGF-β1、ET-1并同各種炎性遞質(zhì)相互作用進(jìn)而延緩氣道重塑有待進(jìn)一步探討。

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