胡 翔 王 靜 陸 華

(1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都，610075;2成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，成都，610041)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為女性絕經(jīng)前后諸癥主要以腎陰虛證為主［1］，臨床實(shí)踐證明中醫(yī)補(bǔ)腎填精法對(duì)潮熱心悸［2］、陰道干澀、煩躁易怒、記憶力下降等低雌激素癥狀體征有明顯改善［3-4］。左歸丸出自明代醫(yī)家張景岳的《景岳全書·新方八陣》，為補(bǔ)益腎陰經(jīng)典方，臨床上可用于治療女性絕經(jīng)前后諸癥［5-6］。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn):絕經(jīng)后女性卵巢功能衰退，體內(nèi)主要通過性腺外組織(脂肪組織間充質(zhì)細(xì)胞［7］等)以腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生的雄烯二酮為底物通過芳香化酶(Romatase Cytochrome P450，P450arom)的催化作用生成雌酮，再轉(zhuǎn)化為活性強(qiáng)的雌二醇(Estradiol，E2)發(fā)揮作用。脂肪是女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素合成的主要部位之一［8］，健康絕經(jīng)后女性的內(nèi)臟脂肪在制造和轉(zhuǎn)化雌酮上比外周脂肪更為重要［9］。3T3-L1前脂肪細(xì)胞是Green和Kehinde于1974年從Swiss3T3小鼠胚胎中分離克隆所得，是目前國(guó)際上公認(rèn)的研究成脂過程的細(xì)胞株，能較好地模擬活體脂肪組織的功能［10-11］，可作為研究脂肪組織芳香化酶表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)載體［12］。本研究以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為平臺(tái)，觀察含左歸丸去勢(shì)大鼠血清對(duì)體外培養(yǎng)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞芳香化酶mRNA表達(dá)的影響，探索左歸丸改善絕經(jīng)后低雌激素水平癥狀的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境 育齡期雌性♀SD大鼠，(230±30)g，77只;購于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于二級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合格證:SCXK(川)2004-11。室溫22～25℃，濕度45% ～65%，晝夜明暗交替時(shí)間為12∶12 h。

1.2 主要藥物和試劑 左歸丸(上海雷允上封濱制藥有限公司)，成人劑量18 g/d，批號(hào):040810;倍美力(惠氏艾爾斯特制藥公司艾爾斯特藥廠生產(chǎn))，規(guī)格:0.625 mg/片，批號(hào):PKG0404001;戊巴比妥鈉(上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝)，批號(hào):F20020405;雌二醇試劑盒(Alpha Diagnostic International公司)，批號(hào):05114-B;3-異丁基 -1-甲基黃嘌呤(Isobuthyl-methylxan-thine，IBMX)、地塞米松(Dexamethasone，Dex)、胰島素(Insulin，Ins)均購于 Sigma公司;RT-PCR試劑盒:Takara，Lot:BK3101;Mouse Aromatase Primer:上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 CK40倒置顯微鏡(日本OLYMPUS);BB5060 CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)HERAEUS);MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo);Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)、DU640紫外分光光度計(jì)(BECKMAN);HBPX220PCR儀(Hybaid);凝膠成像系統(tǒng)及圖象分析軟件(Kodak EDAS 290及Kodak 1D3.5)等。

1.4 動(dòng)物造模及分組 除正常組(20只)外，所有大鼠均腹腔注射麻醉劑戊巴比妥鈉(30 mg/kg，1 mL/100 g)，麻醉成功后腹位固定，消毒手術(shù)區(qū)域。假手術(shù)組(17只)大鼠去除卵巢周圍部分脂肪組織(體積如卵巢大小)，其余40只大鼠行去卵巢手術(shù)。術(shù)后注射抗生素預(yù)防感染，觀察去卵巢大鼠陰道涂片5 d，去勢(shì)成功大鼠陰道涂片無動(dòng)情周期表現(xiàn)。將去勢(shì)成功的大鼠隨機(jī)分為模型組(8只)、陽性對(duì)照組(11只)、左歸丸高劑量組(左高組，6只)、左歸丸低劑量組(左低組，9只)，正常組、假手術(shù)組、模型組每天灌服生理鹽水，左高組、左低組分別灌服左歸丸混懸液(0.6 g/100 g，0.15 g/100 g)，陽性對(duì)照組灌服倍美力水溶液(62.5μg/100 g)［13］，每組動(dòng)物灌胃體積均為1 mL/100 g，3 d稱取一次體重，調(diào)整給藥劑量。連續(xù)灌胃11周，每天陰道涂片觀察陰道上皮細(xì)胞角化率。末次灌藥1 h后股動(dòng)脈放血處死，所得血液靜置2 h后，離心3 000 r/min，15 min，取上層血清以酶聯(lián)免疫法測(cè)定E2值;剩余血清分組混勻，以0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，保存于-70℃冰箱;將大鼠解剖后取得完整子宮稱取濕重。以大鼠子宮重量和血清E2值將正常組、假手術(shù)組大鼠分為正常組動(dòng)情期、正常組動(dòng)情間期、假手術(shù)組動(dòng)情期、假手術(shù)組動(dòng)情間期。

1.5 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞由地奧集團(tuán)d然藥物篩選中心提供。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后以含10%新生小牛血清(New Bron Calf Serum，NCS)、青霉素100 μ/L、鏈霉素100 μ/L的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱中，48 h更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞增殖至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期后，將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，數(shù)量約5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)1 d后，參照文獻(xiàn)方法［14］進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

1.6 各類鼠血清培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞 小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化48 h后，更換培養(yǎng)液:高糖DMEM培養(yǎng)液中含胰島素10 mg/L、丙酸睪酮10μL/mL和2%各類鼠血清。以無鼠血清組(含2%NCS、胰島素和丙酸睪酮)、無丙酸睪酮組(含2%NCS和胰島素)為對(duì)照。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化;取細(xì)胞培養(yǎng)液200μL，3 000 r/min，離心5 min后，取上清液測(cè)定E2值。

1.7 各類鼠血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞芳香化酶表達(dá)的影響 總RNA提取方法參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行，1%瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA質(zhì)量。參照文獻(xiàn)［16］設(shè)計(jì)小鼠芳香化酶上游引物5＇CCTTCCAGCCTTGTCAGGAAACA 3＇，下游引物:5＇CTCCTTGAGGGAAACTCATGCTCC 3＇(435bp)。以小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)對(duì)照(321 bp)。以總RNA 2μg，按cDNA試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄體系為20μL，合成cDNA保存于-20℃待用。按照RT-PCR試劑盒說明書，以Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL。具體反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［17］，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。采用KODAK 1D圖像分析軟件分別檢測(cè)樣品P450arom目的帶和GAPDH內(nèi)對(duì)照帶的光密度值，并以P450arom/GAPDH比值半定量分析P450arom mRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(ˉx±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。高組前脂肪細(xì)胞P450arom mRNA表達(dá)低于模型組(總RNA均為2μg)，高于陽性對(duì)照組(總RNA 4μg時(shí)仍未能成功擴(kuò)增)。

表1 灌服左歸丸高低劑量11周對(duì)去勢(shì)雌鼠體重差的影響(ˉx±s)

表2 灌服左歸丸高低劑量11周對(duì)去勢(shì)雌鼠血清E2值的影響(ˉx±s)

表3 2%各類鼠血清培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞48h后細(xì)胞上清E2值(pg/mL，ˉx±s)

2 結(jié)果

給予左歸丸11周后，左高組、左低組與模型組比較，給藥前后體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給予左歸丸11周后，左高組、左低組與模型組比較，血清E2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2%各類鼠血清培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞48h后，左高組、左低組與模型組比較，血清E2值略有升高。各類鼠血清培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞48 h后，左

圖1 2%各類鼠血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞P450arom mRNA表達(dá)的影響

3 討論

3.1 左歸丸與外源性雌激素作用于去勢(shì)雌鼠脂肪組織的機(jī)制可能不同 本研究發(fā)現(xiàn)左歸丸作用去勢(shì)雌性大鼠11周后，并不引起大鼠外周血中E2明顯升高;與模型組相比，有增加大鼠體重的趨勢(shì)，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前期研究證實(shí)左歸丸對(duì)去勢(shì)大鼠子宮無明顯影響［18］，也說明左歸丸對(duì)雌激素靶器官的作用并非通過提高外周血中雌激素來實(shí)現(xiàn)。后續(xù)研究表明補(bǔ)腎中藥山茱萸內(nèi)所含成分齊墩果酸可明顯增加分化后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞的E2分泌［19］，本研究也證實(shí)含左歸丸鼠血清培養(yǎng)分化中的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，細(xì)胞上清液中E2值有升高的趨勢(shì)，說明左歸丸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞生成E2有一定促進(jìn)作用。在機(jī)體內(nèi)，性腺外合成的雌激素是以旁分泌、細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外自分泌的方式作用于局部組織細(xì)胞［20-21］，局部的雌激素總量可能很少，但濃度高，生物學(xué)效應(yīng)強(qiáng)。推測(cè)左歸丸可能通過某種途徑作用于脂肪細(xì)胞，在一定程度上能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖和分泌雌激素，但作用比較微弱。

很多研究認(rèn)為在未給予外源性雌激素的情況下，雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化與人體脂肪量、超重程度呈高度正相關(guān)［22］，肥胖者脂肪組織較多，激素的轉(zhuǎn)化也增多［23］。而本研究中給予外源性雌激素的去勢(shì)雌鼠，外周血E2遠(yuǎn)高于正常組、假手術(shù)組、模型組和中藥組，給藥前后體重差遠(yuǎn)低于正常組、假手術(shù)組、模型組和中藥組，說明循環(huán)雌激素較高的情況下可能會(huì)抑制脂肪細(xì)胞增殖。

3.2 左歸丸不增加3T3-L1前脂肪細(xì)胞的芳香化酶mRNA表達(dá)，可能通過增強(qiáng)芳香化酶的活性起作用

研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中的芳香化酶主要在未分化間充質(zhì)細(xì)胞中合成［22］。有學(xué)者認(rèn)為女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平降低而脂肪組織的芳香化酶表達(dá)增強(qiáng)［22］，芳香化酶的轉(zhuǎn)錄水平與酶活性無明顯相關(guān)，可能酶活性降低，而芳香化酶轉(zhuǎn)錄水平反而升高［23］。含左歸丸鼠血清培養(yǎng)誘導(dǎo)分化中的3T3-L1前脂肪細(xì)胞后，細(xì)胞P450arom的mRNA表達(dá)低于模型組，而細(xì)胞上清液中E2值升高，說明左歸丸不增加3T3-L1前脂肪細(xì)胞的芳香化酶mRNA表達(dá)，可使P450arom的活性增強(qiáng)。

［1］羅元愷，鄭國(guó)平.以補(bǔ)腎為主治療更年期綜合征臨床研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1990，4(2):23-25.

［2］吳晶，張?zhí)m，侯秀環(huán).滋陰補(bǔ)腎更年方治療圍絕經(jīng)期綜合征臨床觀察［J］.吉林中醫(yī)藥，2008，28(2):108-109.

［3］阮豪驥，吳昆侖.圍絕經(jīng)期腎陰虛證婦女經(jīng)中醫(yī)治療前后血清性激素水平的變化［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(2):88-90.

［4］阮豪驥，吳昆侖.滋陰補(bǔ)腎法治療圍絕經(jīng)期腎陰虛證58例［J］.陜西中醫(yī)，2010，31(7):797-798.

［5］羅頌平，談?dòng)?中醫(yī)婦科學(xué)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012:112.

［6］張鴻宇，羅曉.左歸丸合逍遙丸治療圍絕經(jīng)期綜合征［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(12):295-297.

［7］Simpson ER，Zhao Y，Agarwal VR，et al.Aromatase expression in health and disease［J］.Rec Prog Horm Res，1997，52:185-214.

［8］Kerry J.McInnes，Kristy A.Brown，Kevin C.Knower，et al.Characterisation of aromatase expression in the human adipocyte cell line SGBS Breast［J］.Cancer Research and Treatment，2008，112(3):429-435.

［9］Lise Warming，Pernille Ravn，Claus Christiansen.Visceral fat is more important than peripheral fat for endometrial thickness and bone mass in healthy postmenopausal women［J］.American Journal of Obstetrics＆ Gynecology，2003，188(2):349-353.

［10］Green H，Kehinde O.Spontaneous heritable changes leading to increased adipocyte conversion in 3T3 cells［J］.Cell，1976，7(1):105-113.

［11］Longcope C，Pratt JH，Schneider SH，et al.Aromatization of androgens by muscle and adipose tissue in vivo［J］.Clinical Endocrinology Metabolism，1978，46:146-152.

［12］Zhou J，Gurates B，Yang S，et al.Malignant Breast Epithelial Cells Stimulate Aromatase Expression via Promoter II in Human Adipose Fibroblasts:An Epithelial-Stromal Interaction in Breast Tumors Mediated by CCAAT/Enhancer Binding Protein β1［J］.Cancer Research，2001，61:2328-2334.

［13］滿玉晶，張楠，王秀霞，等.坤寧安對(duì)圍絕經(jīng)期模型大鼠性腺形態(tài)影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15(5):5-7.

［14］Jianbei Deng，Kunjie Hua，Steven S.Lesser，et al.Harp.Activation of Signal Transducer and Activator of Transcription-3 during Proliferative Phases of 3T3-L1Adipogenesis［J］.Endocrinology，2000，141(7):2370-2376.

［15］黃培堂.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.3版.北京:科學(xué)出版社，2005:518-522.

［16］Chow JD，Price JT，Bills MM，et al.A doxycycline-inducible，tissuespecific aromatase-expressing transgenic mouse［J］.Transgenic Res，2012，21(2):415-28.

［17］Spanic T，F(xiàn)abjan T，Majdic G.Expression levels of mRNA for neurosteroidogenic enzymes 17β-HSD，5α-reductase，3α-HSD and cytochrome P450 aromatase in the fetal wild type and SF-1 knockout mouse brain［J］.Endocr Res，2015，40(1):44-8.

［18］陸華，胡翔，王靜.左歸丸對(duì)去勢(shì)雌性大鼠子宮和陰道的影響［J］.中醫(yī)雜志，2009，50(6):544-546.

［19］萬謙，王兆會(huì)，李啟佳，等.齊墩果酸對(duì)分化后的3T3-L1脂肪細(xì)胞的作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(1):68-71.

［20］Simpson E，Rubin G，Clyne C，et al.The role of local estroge n-biosynthesis in males and females［J］.Trends Endocrinol Metab，2000，11(5):184-188.

［21］Labrie F，Belanger A，Cusan L，et al.Marked decline in serum concentrations of adrenal C19 sex steroid precursors and conjugated androgen metabolites during aging［J］.J Clin Endocrinol Metab，1997，28(8):2386-2402.

［22］李琦，張紹芬，張國(guó)福，等.絕經(jīng)后早期婦女體脂分布與雄激素水平的相關(guān)性［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2011，46(5):372-373.

［23］Trant JM，Lehrter J，Gregory T，et al.Expression of cytochrome P450 aromatase in the channel catfish，Ictalurus punctatus［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，1997，61(3-6):393-397.