丁 凱，虞文魁，馮 濤，徐 琳，吳 波，諶達程，李秋榮，李 寧

0 引 言

腹部創(chuàng)傷能夠?qū)е履c屏障通透性增加，全身炎癥反應，腸道菌群移位等，藥物治療有積極的影響［1－2］。據(jù)報道，在膿毒癥休克、結腸炎和燒傷導致的腸屏障功能障礙中，可以通過電刺激或營養(yǎng)活化迷走神經(jīng)的方法預防腸屏障功能的損害［3－6］。Neunlist等［7］報道，對人黏膜下層和單層腸上皮細胞的體外共培養(yǎng)模型電刺激可減少細胞間通透性。本實驗采用腹部創(chuàng)傷大鼠模型研究頸部迷走神經(jīng)電刺激對失血和腸管創(chuàng)傷后腸黏膜屏障的影響，以探索其在臨床創(chuàng)傷救治中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組 健康清潔型雄性SD 大鼠，24 只，體重260 ～300 g，由我院比較醫(yī)學科提供，實驗動物許可證號SCXK-(軍)2012-0014，合格證號0032104，健康狀況符合國家普通實驗動物健康標準。所有大鼠在20 ～25 ℃溫度和60%相對濕度條件下，適應1 周，于實驗前禁食12 h，可自由飲水。

將大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和實驗組，每組12 只，實驗開始前，腹腔內(nèi)注射1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。麻醉完成后備皮，打開上腹部腹腔，行頸部正中切口，暴露氣管，游離右側(cè)頸動脈，行動脈插管。實驗組游離左側(cè)頸部迷走神經(jīng)，連接生物機能實驗系統(tǒng)(購自四川成都東盟軟件公司，BL-420F)，電刺激10 min(連續(xù)單刺激、強度為5 V、頻率為1 Hz、波寬為2 ms)，對照組不予刺激。然后在動脈壓力監(jiān)測下進行放血，平均動脈壓降至30 ～35 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，維持90 min，拔除頸動脈置管。再于上腹部暴露近端空腸，以腸鉗沿長軸方向鉗夾5 cm 腸管并持續(xù)10 min。隨后以相同參數(shù)電刺激實驗組迷走神經(jīng)10 min，對照組不予刺激。以醫(yī)用縫合絲線縫合切口。分別于術后1、6、24 h 取材，每個時間點分配4 只大鼠，大鼠以頸椎脫臼法處死。

1.2 主要試劑和儀器 異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC-Dextra，F(xiàn)D4)購于美國Sigma 公司，其平均相對分子質(zhì)量4000;檢測儀器為Thermo 公司VARIOSKAN FLASH 全波長多功能酶標儀;白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、腸脂肪酸結合蛋白(intestinal fatty acid-binding protein，iFABP)、D-乳酸(DLactate acid，D-LA)、ELISA 試劑盒購自R＆D 公司;檢測用酶標儀為美國BIOTEK 公司產(chǎn)品，型號為ELX800;兔 抗 大 鼠 Occludin、Claudin1/2、ZO-1、GFAP(glial fibrillary acid protein)抗體均購自美國SANTA CRUZ 公司;二抗羊抗兔IgG-HRP 購自美國SANTA CRUZ 公司;電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均為美國BIORAD 公司產(chǎn)品;冷凍高速離心機使用Beckman 公司產(chǎn)品;光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡為德國卡爾·蔡司(Carl Zeiss)公司產(chǎn)品。

1.3 觀察指標

1.3.1 血漿ELISA 檢測 心臟采血，EDTA 抗凝，4 ℃下500×g 離心5 min，取血漿進行ELISA 檢測，按照IL-6、TNF-α、iFABP、D-LA 的ELISA 試劑盒的說明進行操作。每個指標分別以6 個標準品進行標準曲線繪制，計算出血漿中各指標濃度。

1.3.2 腸屏障通透性檢測 以0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)配制FD4 溶液，濃度為25 mg/mL，避光冷藏。動物模型完成后，取材前30 min 打開腹腔，結扎10 cm 中段小腸，形成封閉腸袢，在腸袢腔內(nèi)注射FD4 溶液共0.5 mL，將腸袢還納腹腔。30 min 后于門靜脈抽血0.5 mL，肝素抗凝，避光冷藏送實驗室，4 ℃下500×g 離心5 min 后，取血漿檢測FITC 濃度。再根據(jù)標準曲線計算出對應血漿中FD4 濃度。

1.3.3 腸黏膜緊密連接蛋白檢測 采用Western blot 法和免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測腸黏膜中緊密連接蛋白Occludin、Claudin1/2、Zo-1 的含量和分布。找到盲腸，逆行游離末端回腸，結扎部分回腸系膜，截取2 cm 腸管沿長軸切開，腸黏膜向圓心方向貼壁于凍存管中，置于液氮保存，另取5 cm 腸管刮取腸黏膜于－70 ℃冰箱凍存。

于冰箱中取出腸黏膜標本，稱重切成小塊，放入管中，加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白抽提試劑。用勻漿器以低速勻漿30 s、冰浴1 min，反復多次，直至組織完全裂解。裂解液于預冷至4 ℃的離心機中14 000×g 離心15 min。上清液立刻轉(zhuǎn)入新離心管中保存待用。配制15%濃度SDS-PAGE 分離膠，70 V 電壓電泳完成后，轉(zhuǎn)膜，進行5%脫脂乳封閉，室溫2 h，PBST 洗滌3 遍，5 min/次;大鼠Occludin、Claudin1/2、Zo-1 抗體孵育，4 ℃反應過夜，PBST 洗滌3 次，5 min/次;HRP 標記的兔抗大鼠二抗孵育，室溫2 h，PBST 洗滌3 遍，5 min/次;化學發(fā)光反應液避光孵育，在化學發(fā)光曝光儀中進行曝光、拍照。

自液氮中取出腸管樣本，OCT 包埋后按5 μm 厚度冰凍切片，4%多聚甲醛固定15 min，等滲鹽水沖洗3 次，2 min/次。1%小牛血清白蛋白溶液(BSA)封閉抗原(4 ℃，30 min)，棄去BSA。用BSA 按照1∶150比例稀釋一抗，覆蓋切片，4 ℃反應過夜。等滲鹽水沖洗切片3 次，3 min/次，再用等滲鹽水按照1∶100稀釋二抗，覆蓋切片，4 ℃反應30 min。等滲鹽水沖洗切片3 次，2 min/次，再用等滲鹽水按1∶500稀釋4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，室溫避光下對切片染色1 min，等滲鹽水沖洗切片3 次，隨后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.4 腸壁膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)陽性細胞數(shù)觀察 腸管冰凍切片進行GFAP 標記免疫熒光染色。逆行游離末端回腸，結扎部分回腸系膜，截取5 cm 腸管以中性甲醛固定，進行常規(guī)石蠟包埋切片，HE 染色和GFAP 標記免疫組化染色。病理科醫(yī)師計算每個視野下腸黏膜及黏膜下的GFAP 陽性標記細胞數(shù)量并取平均值。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 6.01 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血漿FD4 水平 迷走神經(jīng)刺激1 h 和6 h，血漿FD4 濃度顯著低于同一時間的對照組(P ＜0.01，P ＜0.05)。見圖1。

2.2 血漿IL-6、TNF-α、iFABP、D-LA 水平 迷走神經(jīng)刺激6 h 和24 h，iFABP 濃度顯著高于同一時間點的對照組(P ＜0.05);IL-6、TNF-α、D-LA 濃度雖然高于同一時間點對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表1。

圖1 血漿中FITC-葡聚糖濃度比較Figure 1 The concentration of plasma FD4

2.3 腸黏膜中緊密連接蛋白水平 Western blot 結果顯示實驗組迷走神經(jīng)刺激1、6、24 h，腸黏膜屏障中緊密連接蛋白Claudin、Occludin、Zo-1 表達水平均顯著高于同時期對照組(P ＜0.01)，見圖2。免疫熒光激光共聚焦實驗結果顯示迷走神經(jīng)刺激6 h Claudin1/2、Zo-1 蛋白在腸黏膜屏障的表達和分布多于對照組，見圖3、圖4。迷走神經(jīng)刺激1、6、24 h，Occludin 蛋白在腸黏膜屏障的表達和分布多于對照組，見圖5。免疫熒光激光共聚焦顯微鏡的觀察結果與Western blot 的結果基本一致。

表1 大鼠血漿中IL-6、TNF-α、iFABP、D-乳酸D-LA 濃度比較(x±s，n=4)Table 1 Comparison of concentrations of plasma IL-6，TNF-α，iFABP，D-LA checked by ELISA，n=4)

表1 大鼠血漿中IL-6、TNF-α、iFABP、D-乳酸D-LA 濃度比較(x±s，n=4)Table 1 Comparison of concentrations of plasma IL-6，TNF-α，iFABP，D-LA checked by ELISA，n=4)

與對照組同一時間比較，*P ＜0.05

IL-6(pg/mL)TNF-α(pg/mL)iFABP(pg/mL)D-LA(μmol/mL)組別1 h 6 h 24 h 1 h 6 h 24 h 1 h 6 h 24 h1 h 6 h 24 h對照組 139.88±15.01 118.86±13.12 115.22±9.35 192.13±20.95 167.67±18.82 168.85±8.41 388.38±68.94 335.72±35.46 318.66±45.84 20.14±1.85 18.48±2.08 14.20±3.08實驗組 141.05±2.54 144.40±12.81 135.94±12.04 201.56±17.07 174.74±36.76 171.50±20.46 415.96±23.20 442.55±16.16* 411.45±26.18*22.22±2.12 21.40±3.59 18.81±1.29

2.4 腸壁中GFAP 陽性細胞數(shù) 對照組及實驗組冰凍切片免疫熒光均可見GFAP 陽性細胞，見圖6。免疫組化結果表明，迷走神經(jīng)刺激1 h，實驗組GFAP 陽性細胞數(shù)顯著高于對照組(P ＜0.01)。迷走神經(jīng)刺激24 h，GFAP 陽性細胞數(shù)顯著低于對照組(P ＜0.01);迷走神經(jīng)刺激6 h，GFAP 陽性細胞數(shù)高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見圖7、圖8。

圖2 Western blot 檢測腸黏膜緊密連接蛋白表達水平Figure 2 The expression levels of tight junction protein in the intestional barrier checked by Western blot

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察迷走神經(jīng)刺激6 h Claudin 蛋白表達Figure 3 The expressions of Claudin checked by confocal laser scanning microscope at the sixth hour by vagus nerve stimulation

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察迷走神經(jīng)刺激6 h ZO-1 蛋白表達Figure 4 The expressions of ZO-1 checked by confocal laser scanning microscope at the sixth hour by vagus nerve stimulation

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察迷走神經(jīng)刺激Occludin 蛋白表達Figure 5 The expressions of Occludin checked by confocal laser scanning microscope at the first，sixth and 24th hour by vagus nerve stimulation

圖6 激光共聚焦觀察迷走神經(jīng)刺激GFAP 蛋白表達Figure 6 The expressions of GFAP checked by confocal laser scanning microscope at the first，sixth and 24th hour by vagus nerve stimulation

圖7 腸黏膜屏障石蠟切片HE 染色和GFAP 的免疫組化染色切片F(xiàn)igure 7 HE stain and immune histology chemistry of GFAP in intestinal mucosal barrier

圖8 免疫組化觀察迷走神經(jīng)刺激1、6、24 h GFAP 陽性細胞數(shù)Figure 8 The number of GFAP positive cells checked by immune histology chemistry at the first，sixth and 24th hour by vagus nerve stimulation

3 討 論

機械屏障是腸黏膜屏障的基礎，是以完整的腸黏膜上皮細胞及上皮細胞間的連接組成。緊密連接是腸黏膜上皮細胞間最主要的連接方式，只允許離子和小分子可溶性物質(zhì)通過，阻止毒性物質(zhì)大分子與微生物通過。機械屏障包括腸蠕動功能，能減少細菌在腸黏膜的時間，起到自潔功能［8］。動物實驗已證明內(nèi)毒素血癥［9］，失血［10］等模型中，電刺激迷走神經(jīng)能夠減輕炎癥反應引起的組織損害和器官功能障礙［11］。

iFABP 是一種在大多數(shù)哺乳動物腸上皮細胞中廣泛表達的細胞質(zhì)蛋白，對長鏈脂肪酸和其他疏水配體高親和力，其參與小腸中脂類的攝取和運輸。體外和體內(nèi)實驗均證實iFABP 在腸脂類代謝和全身能量平衡中具有重要的功能。腸上皮損傷時，會導致iFABP 釋放入血，從而可以間接衡量腸上皮損傷的程度［12］。

D-LA 是腸道固有微生物的代謝終產(chǎn)物，哺乳動物不具備將其快速代謝的能力，其血漿水平變化可部分反映腸通透性的改變［13］。孫曉慶等［14］報道，腸缺血-再灌注損傷、燙傷、急性壞死性胰腺炎模型中，血漿D-LA 可作為腸黏膜損傷、腸屏障通透性改變及腸源性內(nèi)毒素血癥形成的預警指標。

TNF-α 和IL-6 是重要的調(diào)節(jié)炎癥反應的細胞因子，Ayala 等［15］報道，乙醚麻醉SD 大鼠，進行剖腹手術、縫合創(chuàng)口、動脈插管，進行失血處理，分別測定創(chuàng)傷和失血后血漿中IL-6 和TNF-α 表達水平，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷誘導IL-6 水平升高，失血造成TNF-α 水平升高。

我們的研究顯示迷走神經(jīng)刺激6 h 和24 h，實驗組iFABP 濃度顯著高于同一時間點的對照組，此結果需要進一步研究以明確其原因。而IL-6、TNF-α、D-LA 濃度雖高于同一時間點對照組，但差異無統(tǒng)計學意義，說明迷走神經(jīng)刺激對全身的炎癥反應有一定影響，可能與迷走神經(jīng)刺激的部位、強度、作用時間等有關。迷走神經(jīng)刺激1 h 和6 h，血漿FD4 濃度顯著低于同一時間的對照組，說明迷走神經(jīng)刺激使腹部創(chuàng)傷模型大鼠的腸黏膜屏障通透性降低，這有助于保護機體，防止細菌和毒素趁機突破腸屏障進入血液，導致膿毒血癥。

Western blot 結果表明，迷走神經(jīng)刺激1、6、24 h，腸黏膜屏障中緊密連接蛋白Claudin1/2、Occludin、ZO-1 表達水平均顯著高于同時期對照組，而免疫熒光激光共聚焦的結果與Western blot 的結果基本一致。說明迷走神經(jīng)刺激使腹部創(chuàng)傷大鼠腸上皮細胞間的緊密連接蛋白表達增加，這是構成其降低腸通透性的基礎，與實驗組血漿FD4 濃度降低的結果相符。

有實驗表明，腸膠質(zhì)細胞活化能夠通過改變緊密連接蛋白的表達，增強腸屏障功能。在燒傷模型中，迷走神經(jīng)刺激能夠防止燒傷引起的腸屏障損傷。在燒傷前進行迷走神經(jīng)刺激使腸壁中GFAP 表達增高;燒傷后注射一種由活化的腸膠質(zhì)細胞釋放的信號分子S-亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)，可起到與迷走神經(jīng)刺激相似的保護作用［3］。

冰凍切片免疫熒光可見實驗組的GFAP 陽性細胞，同時免疫組化實驗結果顯示實驗組迷走神經(jīng)刺激1 h，GFAP 陽性細胞數(shù)顯著高于對照組，刺激24 h，GFAP 陽性細胞數(shù)顯著低于對照組，說明腸膠質(zhì)細胞GFAP 在迷走神經(jīng)刺激1h 表達增加，腸膠質(zhì)細胞活動明顯增強，從而穩(wěn)固腸屏障平衡。但是在迷走神經(jīng)刺激24 h 卻表達下降，這與Costantini 等［5］在燒傷小鼠模型中觀察到的迷走神經(jīng)刺激結果一致，具體機制有待更進一步研究。

迷走神經(jīng)刺激對腹部創(chuàng)傷后腸屏障的影響較為復雜，可能與改變腸膠質(zhì)細胞的活躍度及功能相關，但還需要進一步深入研究，從而為臨床治療提供更多樣化的思路。

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