余景偉 胡克

[摘要] 目的 探討土荊皮酸對肺癌細胞系A(chǔ)549細胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機制。 方法 體外培養(yǎng)的A549細胞，用不同濃度的土荊皮酸（0、4、8、16、32 μmol/L）處理24、48、72 h，MTT法測定其對A549細胞增殖的影響；土荊皮酸（0、4、8、16 μmol/L）處理A549細胞48 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期，分光光度計檢測Casepase-3相對活性，Western blot法檢測PTEN、Akt、p-Akt的表達。 結(jié)果 土荊皮酸能有效抑制A549細胞增殖，且呈濃度和時間依賴性（P < 0.05）；土荊皮酸作用A549細胞48 h后，細胞凋亡率從14.8%上升至37.7%，顯著高于對照組（土荊皮酸0 μmol/L）（P < 0.05）；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，土荊皮酸能抑制細胞的G1期行進和G1/S轉(zhuǎn)換；Casepase-3相對活性顯著增加（P < 0.05）；土荊皮酸可上調(diào)PTEN表達并抑制p-Akt的表達（P < 0.05）。 結(jié)論 土荊皮酸可抑制A549細胞增殖并促進其凋亡，其作用機制可能與上調(diào)PTEN并抑制Akt信號通路，繼而阻滯細胞周期并激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 土荊皮酸；A549細胞；凋亡；PTEN；Akt信號通路

[中圖分類號] R734 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（a）-0018-05

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[1-2]，化療是主要的治療方法，然而傳統(tǒng)的化療藥物毒副作用大，患者難以耐受，且常常出現(xiàn)耐藥情況，治療效果不佳。因此，從天然植物中尋找高效低毒的具有抗腫瘤活性的成分成為了國內(nèi)外研究熱點。土荊皮酸（Pseudolaric acid B，PAB）是從荊樹皮中提取的具有多種藥理活性的二萜類化合物，前期研究發(fā)現(xiàn)，PAB可抑制多種腫瘤細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡[3-4]，然而其抗腫瘤機制尚不明確，本研究旨在探討PAB對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響，并探討PAB可能的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株：肺癌細胞系A(chǔ)549細胞，購于中國科學(xué)院上海細胞庫。主要試劑：PAB購于哈爾濱弘博生物科技有限公司，細胞周期檢測試劑盒和AnnexinV/PI凋亡試劑盒購于BENDER公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購于碧云天生物技術(shù)研究所；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、辣根酶標記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG均購自武漢博士德生物科技有限公司；Caspase-3活性檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；PTEN、Akt、p-Akt（Ser473）及內(nèi)參β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對于貼壁細胞培養(yǎng)方法，大約每2天換培養(yǎng)基1次，大約3 d傳代1次，每次均取生長狀態(tài)良好的并處于對數(shù)期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗檢測細胞活力 將對數(shù)生長期的細胞配制成1×104個/mL的細胞混懸液，將混懸液按每孔100 μL加入96孔培養(yǎng)板，在孵箱中孵育培養(yǎng)約24 h后取出，棄上清，每孔加200 μL RPMI-1640培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h后取出，棄上清。實驗組換PAB終濃度為2、4、8、16、32 μmol/L培養(yǎng)液，對照組未加PAB（0 μmol/L），每組5個復(fù)孔。然后放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24、48、72 h，于實驗結(jié)束前4 h棄孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL MTT（濃度為0.5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)液體，加入100 μL DMSO。振蕩15 min后酶標儀測吸光度（A490），根據(jù)公式計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=1-（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期的細胞配制成1×106個/mL的細胞混懸液，將懸液接種于6孔板中，在孵箱中孵育培養(yǎng)約24 h后取出，棄上清。實驗組換PAB終濃度為2、4、8、16、32 μmol/L培養(yǎng)液，對照組未加PAB（0 μmol/L），放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后收集細胞，預(yù)冷PBS洗滌細胞2次，并將細胞重懸于Binding Buffer中。加入5 μL Annexin V-FITC室溫、避光反應(yīng)10 min，加入5 μL PI混勻，室溫、避光反應(yīng)5 min。篩網(wǎng)過濾后，上流式細胞儀機檢測細胞凋亡率。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞接種及分組同上，收集細胞，洗滌、離心后加入75%預(yù)冷乙醇固定過夜，棄掉乙醇，加入RNase和PI室溫避光染色，篩網(wǎng)過濾后，送上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5 分光光度法檢測Caspase-3活性變化 細胞接種及分組同上，收集細胞，加入100 μL裂解液+1.742 μL PMSF蛋白酶抑制劑重懸細胞，用移液器吹打細胞置混勻，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上裂解約45 min。后12 000 r/min，4℃離心30 min，后吸取上清，并放置于冰上，用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)Caspase-3活性檢測試劑盒操作方法操作，其原理是基于Caspase-3可催化底物Ac-DEVD-pNA并產(chǎn)生黃色的對硝基苯胺（p-nitroaniline，pNA），后者可產(chǎn)生吸光度，間接反映細胞內(nèi)Caspase-3活性。根據(jù)結(jié)果調(diào)好蛋白濃度（2～4 g/L），再加入緩沖液20 μL多次吹打均勻后加入Caspase-3反應(yīng)底物Ac-LEHD-pNA 5 μL，再放置培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，之后酶標儀測定405 nm處吸光值（OD405）。

1.2.6 Western blot檢測PTEN、Akt和p-Akt（Ser473）蛋白表達 細胞接種及分組同上，收集細胞，加入100 μL裂解液+1.742 μL苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑重懸細胞，用移液器吹打細胞置混勻，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上裂解約45 min。12 000 r/min，4℃離心30 min，后吸取上清，將樣品分裝至預(yù)冷的EP管中，-80℃保存。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，加入1/5體積的5×上樣緩沖液至提取的細胞蛋白樣品中，沸水煮沸5 min，-20℃保存。將細胞蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（上樣量20 μg/孔），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，再加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，根據(jù)條帶蛋白分布不同加入1∶1000稀釋的兔抗或鼠抗人PTEN、Akt、p-Akt（Ser473）抗體，4℃冰箱內(nèi)過夜，其中β-actin為內(nèi)參，次日洗膜緩沖液（TBST）洗膜后，根據(jù)一抗來源不同分別加入1∶1000稀釋的辣根酶標記的山羊抗或山羊抗鼠二抗，室溫放置2 h，再次TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，暗室內(nèi)顯影并觀察各條帶深淺變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAB對A549細胞活力的影響

如表1所示，PAB對A549細胞的增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時間越長，其發(fā)揮抗腫瘤作用效果亦越好。

2.2 土荊皮酸對A549細胞凋亡的影響

A549細胞經(jīng)PAB處理48 h后，流式細胞儀凋亡檢測結(jié)果顯示，PAB各實驗組的細胞凋亡率較對照組（0 μmol/L）的凋亡率（0.6%）明顯升高，從14.8%上升至37.7%，較對照組的凋亡率（0.6%）明顯升高（P < 0.05）。表明PAB能誘導(dǎo)細胞凋亡。見圖1。

a b

c d

a：對照組；b：4 μmol/L土荊皮酸；c：8 μmol/L土荊皮酸；d：16 μmol/L土荊皮酸

圖1 土荊皮酸對肺癌A549細胞凋亡率的影響

2.3 PAB對A549細胞周期的影響

流式細胞儀檢測細胞周期數(shù)據(jù)顯示，PAB能抑制A549細胞的G1期行進和G1/S轉(zhuǎn)換，S期細胞比例降低，表示PAB能夠阻滯細胞周期。見圖2。

2.4 土荊皮酸對A549細胞Caspase-3活性的影響

Caspase-3活性檢測結(jié)果顯示，PAB（4、8、16 μmol/L）處理后，A549細胞Caspase-3相對活性較對照組（0 μmol/L）明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.5 土荊皮酸對A549細胞PTEN、Akt、p-Akt表達的影響

PAB（4、8、16 μmol/L）作用A549細胞48 h后，Western blot檢測PTEN、Akt、p-Akt，如圖4所示，細胞PTEN表達增加，總的Akt表達量沒有變化，而p-Akt表達減少，呈濃度依賴性，灰度值分析顯示，PAB（4、8、16 μmol/L）與對照組（0 μmol/L）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。表明PAB能上調(diào)PTEN，抑制Akt磷酸化。

3討論

細胞凋亡機制在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中扮演著重要角色，是重要的生理調(diào)控機制[5]，細胞無限增殖及細胞凋亡相對或絕對數(shù)不足在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[6]，誘導(dǎo)細胞凋亡可能是抗腫瘤治療最有效的途徑之一，因此，針對誘導(dǎo)細胞凋亡機制的藥物，特別是天然化合物的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外抗腫瘤研究的熱點。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAB對A549細胞的增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時間越長，其發(fā)揮抗腫瘤作用效果亦越好。本研究還檢測了PAB處理A549細胞后細胞周期改變，結(jié)果顯示，PAB能阻滯A549細胞的G1期行進和G1/S轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致S期細胞比例降低，提示PAB可能通過阻滯細胞周期抑制細胞增殖。此外，本研究進一步探討了PAB對是否通過誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抑制細胞的增殖作用。結(jié)果顯示，PAB處理A549細胞后，細胞凋亡率隨著藥物濃度的升高而明顯升高。上述表明PAB能抑制肺癌細胞增殖，同時促進細胞凋亡。

關(guān)于細胞凋亡的途徑及信號通路，目前研究發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡途徑主要包括內(nèi)部線粒體途徑、外部死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。Caspase作為半胱氨酸蛋白酶類，其家族在內(nèi)部線粒體凋亡途徑中起著重要作用，可特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵，是導(dǎo)致凋亡的直接效應(yīng)物。其中Caspase-3是效應(yīng)凋亡蛋白酶，其被切割活化后，細胞凋亡則進入不可逆轉(zhuǎn)階段[7]。Caspase-3在起始凋亡蛋白酶切割激活活化后，可通過裂解細胞凋亡抑制蛋白、細胞DNA修復(fù)相關(guān)分子、細胞骨架蛋白和細胞外基質(zhì)蛋白等機制，最終促進細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，PAB處理后，A549細胞內(nèi)Caspase-3活性顯著升高，提示PAB可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)肺癌A549細胞凋亡。

本研究進一步探討了PAB引起凋亡的機制。磷酸酶基因（phosphatase and tensin homologue deleted in chromosome，PTEN）是1997年發(fā)現(xiàn)并命名的一種具有雙重特異性磷酸酶活性抑癌基因，因其在多種進展期腫瘤中均發(fā)生突變，又被稱為多發(fā)性進展期腫瘤突變基因（mutated in multiple advanced cancer-1，MMAC-1）。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在多種腫瘤細胞包括大腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、肺癌中突變，表達下調(diào)甚至缺失[8-11]。已經(jīng)證實，PTEN發(fā)揮抑癌作用主要依靠其磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子PI3P，進而阻斷PI3K/AKT信號通路，即PTEN-PI3K/AKT信號通路[12-13]。PTEN基因的失活導(dǎo)致PI3K/AKT信號通路異?；罨惓；罨腁KT繼而產(chǎn)生促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡，增強腫瘤細胞黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，促進血管生成等多種生物學(xué)效應(yīng)[14]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有極其重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，PAB處理A549細胞后，細胞PTEN表達上調(diào)，同時，細胞總的Akt表達量沒有變化，而p-Akt表達減少，兩者表達呈負相關(guān)，表明PAB能上調(diào)PTEN從而抑制Akt信號通路。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAB可抑制A549細胞增殖，并促進細胞凋亡，其機制可能與PAB上調(diào)抑癌基因PTEN從而抑制Akt信號通路，繼而阻滯細胞周期并激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。有關(guān)PAB的潛在抗腫瘤機制尚需進一步深入探索和研究。

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（收稿日期：2014-10-14 本文編輯：任 念）