馮瀅瀅，郭靖，劉家宏，徐小潔，張?jiān)旗o，陳云萍，葉棋濃，趙克

1.第二炮兵總醫(yī)院 結(jié)直腸肛門外科，北京 100088；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；

3.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤一科，北京 100048；4.解放軍180醫(yī)院 內(nèi)3科，福建 泉州 362000

NK2轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因位點(diǎn)3（NKX2-3）是同 源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子NKX家族中的重要成員，可調(diào)節(jié)細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，參與組織分化和發(fā)育[1-3]。研究顯示NKX2-3不僅影響腸道免疫炎癥反應(yīng)，是炎性腸?。↖BD）相關(guān)性基因[4-5]，而且可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及腫瘤形成等作用，從而參與散發(fā)性和IBD相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)病[6]。因此，我們決定構(gòu)建帶Flag標(biāo)簽的NKX2-3真核表達(dá)載體，并探討其對(duì)結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞系、人肝癌HepG2細(xì)胞系、人胚腎293T細(xì)胞系、大腸桿菌DH5α、帶Flag標(biāo)簽的pcDNA3.0載體由本室傳代培養(yǎng)；人乳腺文庫(kù)由本室保存；限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR回收試劑盒、質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM為Gibco公司產(chǎn)品；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測(cè)序由北京博邁德生物技術(shù)有限公司完成；HRP標(biāo)記的小鼠抗Flag M2標(biāo)簽單克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 Flag-pcDNA3.0-NKX2-3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

根據(jù)在NCBI網(wǎng)站查詢的NKX2-3編碼序列（NC_000010.11）合成上游引物（5'-CGGGATCCAT GATGTTACCAAGCCCGGTCA-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGCTACCAGGCCCGGATGCCCTGC-3'），PCR擴(kuò)增人NKX2-3的編碼序列（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸150 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延長(zhǎng)7 min），4℃保存，膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物；用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切帶Flag標(biāo)簽的pcDNA3.0載體，經(jīng)37℃、12 g/L瓊脂糖凝膠電泳4 h后，膠回收載體大片段；將PCR片段用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA連接酶與帶Flag標(biāo)簽的pcDNA3.0載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆，振蕩培養(yǎng)后對(duì)菌液PCR鑒定陽(yáng)性的提取質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的克隆送北京博邁德生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞和Western印跡檢測(cè)

將人胚腎293T細(xì)胞接種于2塊6 cm皿中，皿中載有含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)70%～80%的細(xì)胞密度為宜，轉(zhuǎn)染前1 h 換液。將 4 μL VigoFect與 200 μL NaCl溶液混合，靜置 5 min；期間將 10 μg重組質(zhì)粒與 200 μL NaCl溶液混合，輕柔吹打混勻后將上述2種溶液混勻，室溫靜置15 min后均勻加入6 cm皿中，同法轉(zhuǎn)染Flag-pcDNA3.0載體作為對(duì)照；37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h換液，24 h后收取細(xì)胞，3000 r/min離心5 min，棄上清，加2倍細(xì)胞量的RIPA，冰上裂解20～30 min，繼續(xù)加入等量2×SDS上樣緩沖液，沸水煮15 min，12 000 r/min離心 2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，用HRP標(biāo)記的抗Flag標(biāo)簽鼠單克隆抗體室溫孵育1 h，抗體用5%脫脂奶粉1∶5000稀釋，1×TBST洗膜3次，5 min/次；化學(xué)發(fā)光法顯色10 min，壓片顯影。

1.4 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

Flag-pcDNA3.0-NKX2-3 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 HCT-116、HepG2細(xì)胞24 h后，與轉(zhuǎn)染Flag-pcDNA3.0空載體的對(duì)照HCT-116、HepG2細(xì)胞同時(shí)以3000/孔的密度接種于5塊96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔含培養(yǎng)基100 μL，分別在第0、1、2、3、4 d同一時(shí)間吸棄原培養(yǎng)基，加入含10 μL CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，37℃、5%CO2孵育1 h，測(cè)定D450nm值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸、D450nm值平均值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 Flag-pcDNA3.0-NKX2-3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)NCBI查詢的NKX2-3編碼序列合成上、下游引物后PCR擴(kuò)增人NKX2-3的編碼序列，獲得長(zhǎng)約1080 bp的DNA片段，與預(yù)期一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，與同樣經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ酶切的Flag-pcDNA3.0載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶1080 bp大小接近（圖2）的克隆，則初步認(rèn)為是帶有人NKX2-3基因的陽(yáng)性重組克隆。將所得陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長(zhǎng)度分別約為5000和1080 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切只見大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖3）。DNA序列測(cè)定結(jié)果表明，插入的DNA序列與人NKX2-3基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

圖1 PCR擴(kuò)增人NKX2-3的編碼序列M：DL2000 DNA marker；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒Flag-pcDNA3.0-NKX2-3的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜M：DL2000 DNA marker；1：陰性對(duì)照（無(wú)模板的PCR擴(kuò)增）；2：以乳腺文庫(kù)為模板PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性對(duì)照；3～5：Flag-NKX2-3的1～3號(hào)克隆的菌液PCR結(jié)果

2.2 Western印跡檢測(cè)Flag-NKX2-3在293T細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的Flag-NKX2-3重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，24 h后提蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western印跡檢測(cè)Flag-NKX2-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，F(xiàn)lag-HRP抗體在相對(duì)分子質(zhì)量約43×103處檢測(cè)到明顯特異性條帶，而空載體無(wú)條帶，說(shuō)明Flag-NKX2-3能夠在293T細(xì)胞系中正確表達(dá)，而空載體不表達(dá)。

2.3 CCK8法檢驗(yàn)Flag-NKX2-3對(duì)腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的抑制作用

有研究顯示，NKX2-3基因主要有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及腫瘤形成的作用。我們將Flag-NKX2-3真核表達(dá)載體及Flag-pcDNA3.0載體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞系、肝癌HepG2細(xì)胞系，用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖5所示，NKX2-3能抑制這2種細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3 討論

NKX2-3作為NKX同源轉(zhuǎn)錄因子家族成員，主要表達(dá)于腸道和脾臟中胚層起源的組織細(xì)胞，如腸道黏膜固有層和黏膜下層的微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞，在脾臟和腸道集合淋巴結(jié)中可影響B(tài)細(xì)胞成熟和T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)。NKX2-3缺陷小鼠實(shí)驗(yàn)揭示了NKX2-3在脾臟、小腸形成和發(fā)展中的重要作用，以及對(duì)黏膜定居因子細(xì)胞黏附分子1（MADCAM-1）的重要意義[1,7-9]，許多研究也證實(shí)其在炎性腸病發(fā)病中舉足輕重的作用[5,10]。在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)NKX2-3能抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能是一個(gè)抑癌基因。這與近幾年的研究結(jié)果相符。

Phiel曾在2001年報(bào)道NKX2-3可能在平滑肌肉瘤形成中發(fā)揮作用[11]。2008年Wang報(bào)道NKX2-3在散發(fā)性腸癌患者癌組織中較正常組織低表達(dá)，可能是一個(gè)抑癌基因[12]。轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)下游基因，2009年Yu發(fā)現(xiàn)NKX2-3在Crohn病患者病變腸道組織中高表達(dá)[13]，于是他在2株腸癌細(xì)胞株（散發(fā)性結(jié)腸癌細(xì)胞株和炎性腸病相關(guān)性腸癌細(xì)胞株）中篩選檢測(cè)所有受NKX2-3影響的基因,發(fā)現(xiàn)分別有1677和1375個(gè)基因受其調(diào)控,其中至少7個(gè)基因是Wnt信號(hào)通路上的，Wnt信號(hào)通路的失調(diào)是結(jié)腸癌形成機(jī)制中的重要事件，推測(cè)NKX2-3通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路參與了炎性腸病相關(guān)的腸癌和散發(fā)性腸癌的發(fā)病過(guò)程[6]。同年，Leja在研究胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)NKX2-3在肝轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)比在正常腸黏膜組織和原發(fā)腫瘤組織中明顯低，推測(cè)NKX2-3可能參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[14]。

圖3 重組質(zhì)粒Flag-NKX2-3的XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切電泳圖譜M：DL2000 DNA marker；1：空載體Flag-pcDNA3.0-NKX2-3；2：重組質(zhì)粒Flag-NKX3-2

圖4 Western印跡檢測(cè)Flag-NKX2-3蛋白的表達(dá)1：轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的293T細(xì)胞；2：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-NKX2-3的293T細(xì)胞

圖5 NKX2-3抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

除此之外，Yu在2011年的另一項(xiàng)研究中再次證實(shí)受NKX2-3調(diào)節(jié)的基因至少有1000個(gè)，涉及眾多信號(hào)通路，其中最重要的有G蛋白偶聯(lián)受體通路、ERK/MAPK信號(hào)通路、VEGF-PI3K/AKT通路，參與了免疫炎性反應(yīng)，血管形成，細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和腫瘤形成，代謝過(guò)程，細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移等，并且證實(shí)NKX2-3的下調(diào)激活了MAPK信號(hào)通路[15]。這和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，也解釋了NKX2-3抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)可能與抑制MAPK通路有關(guān)，但還須進(jìn)行深入研究。

綜上所述，NKX2-3是一個(gè)與癌癥關(guān)系密切的多功能抑癌基因。我們構(gòu)建的Flag-NKX2-3重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中獲得了表達(dá)，易于檢測(cè)，表達(dá)的NKX2-3蛋白能夠抑制結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，這為進(jìn)一步了解NKX2-3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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