張云靜 ，馮瀅瀅，徐小潔，梁迎春，張立，王濤，李玲，郭靖，紀(jì)貝貝，張蓉，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.第二炮兵總醫(yī)院，北京 100088；3.總參警衛(wèi)局 衛(wèi)生保健處，北京 100017

N-ras基因是由神經(jīng)母細胞瘤DNA 感染小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3 而發(fā)現(xiàn)的一種Ras基因，與H-Ras、K-Ras共同組成Ras基因家族。N-Ras基因位于人類1號染色體短臂（1p22-p32），內(nèi)部含有1個非編碼外顯子和4 個編碼外顯子，編碼相對分子質(zhì)量為21×103的蛋白單體（又稱為p21 蛋白）。Ras 蛋白是一種位于細胞膜內(nèi)側(cè)的信號傳遞小G 蛋白，具有GTP酶活性，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[1]。它是細胞信號傳遞中的“分子開關(guān)”，與GTP 結(jié)合為活化狀態(tài)，與GDP 結(jié)合為失活狀態(tài)，在細胞的分化與增殖中起重要作用。

Ras基因為癌基因，點突變?yōu)槠涑Ｒ姷募せ罘绞剑s30%的惡性腫瘤存在Ras基因的突變[2]。Ras基因突變激活，其表達產(chǎn)物Ras 蛋白發(fā)生構(gòu)型改變，處于持續(xù)活化狀態(tài)，使細胞增殖失去控制，導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化[3]。不同Ras基因突變可以導(dǎo)致不同的腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，N-Ras基因突變可導(dǎo)致髓系惡性腫瘤[4]、黑色素瘤[5]、甲狀腺腫瘤[6]、膀胱癌[7]、惡性膠質(zhì)瘤[8],研究N-Ras基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及演變過程中的作用有重要意義。為此，我們從人乳腺文庫中擴增出N-Ras 蛋白的全長編碼序列，利用GST 融合蛋白表達系統(tǒng)構(gòu)建原核表達載體，誘導(dǎo)并純化NRas蛋白，為后續(xù)深入研究N-Ras基因?qū)δ[瘤細胞的影響奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺文庫，大腸桿菌DH5α、Rossate 感受態(tài)，原核表達載體pGEX-KG 為本室保存；高保真primer STAR DNA 聚合酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶及其緩沖液、Taq酶為TaKa-Ra 公司產(chǎn)品；PCR 回收、膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega 公司；GST-Sepharose 4B 購自Pharmacia公司；人GST 抗體購自Santa Cruz 公司；測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 人N-Ras蛋白全長編碼區(qū)基因的擴增

根據(jù)NCBI 查詢的人N-Ras 編碼序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGACTGAGTACAAACTGGT GGTG-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGTTACATC ACCACACATGGCAATCC-3'），利用PCR 方法，用高保真primer STAR DNA 聚合酶從人乳腺文庫中擴增人N-Ras 編碼序列。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，30 個循環(huán)，72℃延長7 min。PCR 結(jié)束后，行瓊脂糖凝膠電泳，將位置正確的特異條帶用膠回收試劑盒回收。

1.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定

將pGEX-KG 載體用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR 回收產(chǎn)物，使其形成帶黏端的雙鏈；用T4DNA 連接酶將其連接入pGEXKG 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.4 融合蛋白GST-N-Ras 在大腸桿菌中的小量誘導(dǎo)表達及鑒定

將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate 感受態(tài)細胞，挑取菌落至含有氨芐西林的LB 液體試管中，37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6～1.0，取500μL 菌液用于保菌，取500μL 菌液離心收集菌體作為誘導(dǎo)前對照，剩余菌液中加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，取500μL菌液離心收集菌體作為誘導(dǎo)后樣品，進行SDS-PAGE檢測。

1.5 融合蛋白GST-N-Ras的純化與洗脫

將小量誘導(dǎo)表達及鑒定正確的Rossate 菌接種于含氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜活化，按10%的比例轉(zhuǎn)種于同種液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L，于20℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h，4℃、10 000 r/min 離心10 min 后收集菌體，加入裂解液，吹勻后冰浴30 min，用超聲波儀破碎菌體，4℃、10 000 r/min 離心10 min 后收集上清，加入200μL GST-Sepharose 4B 結(jié) 合4 h，離心收 集GST-Sepharose 4B 小顆粒，充分洗脫后即為結(jié)合蛋白質(zhì)。利用還原性谷胱甘肽小量多次地將GST-NRas 從珠子上逐漸洗脫，最后經(jīng)SDS-PAGE 鑒定純化與洗脫的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 人N-Ras編碼區(qū)基因的克隆

以人乳腺文庫為模板，PCR 擴增N-Ras 編碼區(qū)全長序列，獲得與預(yù)期片段大小一致的600 bp 左右的PCR產(chǎn)物（圖1）。

2.2 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pGEX-KG 載體，膠回收較大片段；將PCR 產(chǎn)物用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后膠回收；用T4DNA 連接酶及其緩沖液將上述2片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑克隆，利用Taq酶行菌液PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小約為600 bp 者為陽性克隆（圖2）；將陽性克隆提質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，如在600 bp 左右出現(xiàn)特異條帶（圖3），表明N-Ras 的編碼序列已成功插入pGEX-KG 上游的多克隆位點中。經(jīng)DNA 序列測定，該序列與已知序列完全一致，無突變發(fā)生（序列數(shù)據(jù)略）。

2.3 融合蛋白GST-N-Ras的誘導(dǎo)表達及鑒定

將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rossate 感受態(tài)細胞，挑取菌落至含氨芐西林的LB 液體試管中,37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6～1.0，取500μL 菌液離心收集菌體作為誘導(dǎo)前對照，后加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，37℃培養(yǎng)4～6 h，取500μL 菌液離心收集菌體作為誘導(dǎo)后樣品，行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)GST-N-Ras融合蛋白獲得正確表達（圖4）。

圖1 N-Ras基因的PCR擴增產(chǎn)物

2.4 融合蛋白GST-N-Ras的純化與洗脫

用GST-Sepharose 4B 親和珠純化得到融合蛋白，經(jīng)還原性谷胱甘肽小量多次洗脫，考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示獲得一定量的純度較高的GST-N-Ras（圖5）。

3 討論

Ras家族有三大成員，即K-Ras、H-Ras和NRas。目前，研究報道比較多、機制相對較明確的是K-Ras對腫瘤細胞的影響及耐藥性的研究，而對于N-Ras基因與腫瘤的報道相對較少。Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/PTEN 信號傳導(dǎo)通路對細胞的生長、繁殖與分化具有重要意義[9-13]，而N-Ras基因是該信號通路中重要的調(diào)控因子，N-Ras基因的突變可致細胞持續(xù)生長，甚至腫瘤發(fā)生[5]。

圖2 重組質(zhì)粒的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜

圖3 重組質(zhì)粒的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定

有研究報道，N-Ras第61 位密碼子發(fā)生點突變占所有Ras突變的67%～88%[14-15]，而且不同腫瘤組織中N-Ras基因的表達率不同[16]。Colombino 等[17]報道，在15%N-Ras基因突變的黑色素瘤患者中，黑色素瘤細胞增殖與N-Ras基因密切相關(guān)，隨著黑色素瘤細胞的增殖，細胞內(nèi)N-Ras的蛋白和mRNA 水平顯著增加。在甲狀腺濾泡狀癌中，N-Ras第61 位密碼子發(fā)生點突變是比較普遍的（突變率26.8%），這種突變的發(fā)生為臨床上更為精確地診斷甲狀腺癌提供了證據(jù)，同時也能預(yù)測甲狀腺濾泡狀癌的危險程度[18]。在急性髓系白血病[4]、多發(fā)性骨髓瘤[19]患者中也存在N-Ras突變的情況，其機制可能是由于突變導(dǎo)致編碼的Ras 蛋白構(gòu)型改變，使其處于功能持續(xù)活化狀態(tài)，從而激活了Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等下游信號傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生，但具體機制還有待于繼續(xù)深入研究。也有個案報道，在原發(fā)性腦間質(zhì)腫瘤、痣同時伴有神經(jīng)與皮膚惡性黑色素瘤患者中，發(fā)現(xiàn)存在N-Ras基因第13 位密碼子的突變，這可能是多種因素作用的結(jié)果，研究者推斷與RAF-MEK-ERK、RalGDS、PI3K-AKT/PDK1和PLC/PKC 信號通路有關(guān)，具體機制需要深入研究[20]。盡管有充足的實驗數(shù)據(jù)證明N-Ras基因突變與多種腫瘤的進展、惡性轉(zhuǎn)化及預(yù)后密切相關(guān)，但其具體作用機制、臨床上的指導(dǎo)意義及其耐藥性還不是十分清楚，為我們進一步深入研究指明了方向。

綜上，我們利用原核表達系統(tǒng)誘導(dǎo)表達了重組蛋白GST-N-Ras，并用Sepharose-4B 珠子對重組蛋白進行了純化，為后續(xù)深入研究N-Ras基因影響腫瘤細胞的具體機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

圖4 GST-N-Ras融合蛋白的SDS-PAGE分析

圖5 GST-N-Ras融合蛋白純化并洗脫后的SDS-PAGE分析

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