賈慧,齊連權(quán)，梁艷，常翠云，王鑫，徐俊杰，陳薇

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所 北京 100071；2.北京泰德制藥股份有限公司，北京 100176

人促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）是一種治療女性不孕的重要藥物，主要用于治療女性無排卵性不孕癥、控制性卵巢刺激和輔助生殖技術(shù)等。FSH是一個異源二聚體的糖蛋白激素，由垂體前葉產(chǎn)生，相對分子質(zhì)量約30×103。FSH由一個α亞基和一個β亞基經(jīng)非共價鍵連接[1]，其中α亞基與其他糖蛋白激素如促甲狀腺素（thyroid stimu?lating hormone，TSH）、促黃體生成素（luteotropic hormone，LH）、胎盤產(chǎn)生的絨毛膜促性腺激素（chori?onic gonadotrophin，CG）一致，而β亞基為FSH所特有，發(fā)揮生物學(xué)活性。FSH用于女性不孕癥的治療已有40余年。目前，F(xiàn)SH主要來源為從絕經(jīng)期婦女尿液中提取和在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)純化重組FSH，由于重組FSH的高純度和高度安全性，在過去20年被廣泛接受和使用[2]。

迄今惟一被國內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)和認(rèn)可的FSH的體內(nèi)活性測定方法仍為半個世紀(jì)前建立[3-6]，該方法是基于FSH對雌性幼大鼠卵巢有增重作用。根據(jù)2010年版中國藥典二部附錄Ⅻ，F(xiàn)SH生物測定法采用的是比較尿促性素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對幼大鼠卵巢增重的作用，以測定供試品中FSH的效價。但是該方法具有很多局限性，如耗時長、操作繁瑣，以及對結(jié)果重復(fù)性的限制等，并且該方法依賴于較高的實(shí)驗(yàn)技能。由于該方法須使用雌性幼大鼠，鼠齡要求嚴(yán)格，所以對待檢樣品的前期制備、貯存、運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)過程中的樣品保存等有極高的穩(wěn)定性要求。另外，大量動物的使用還存在倫理學(xué)上的問題?；诖?，歐盟委員會聯(lián)合各醫(yī)藥、化學(xué)制品、化妝品及生物制品企業(yè)，計劃在產(chǎn)品開發(fā)和放行檢測過程中盡量減少實(shí)驗(yàn)動物的數(shù)量[7]。

由于體內(nèi)活性檢測的局限性和限制性，近期上市的幾個FSH產(chǎn)品使用了幾種物理化學(xué)方法替代體內(nèi)活性對產(chǎn)品進(jìn)行檢測，例如分子排阻高效液相色譜法、定量等電聚焦電泳法[8-10]。這些物理化學(xué)方法與傳統(tǒng)的大鼠卵巢增重法（Steelman-Pohley法）相比，精確度有很大的提高，但是與生物學(xué)活性的特異相關(guān)性不高，包括酶聯(lián)免疫方法等物理化學(xué)方法都不能很好地反應(yīng)產(chǎn)品的生物學(xué)活性。

基于此，我們開發(fā)了一種體外細(xì)胞的活性測定方法，用人FSH的靶細(xì)胞來評價FSH的生物學(xué)活性。初級卵巢細(xì)胞的成熟由FSH誘導(dǎo)形成，所以在哺乳動物卵巢中顆粒細(xì)胞是FSH天然的靶細(xì)胞。FSH受體是G蛋白家族的一種跨膜蛋白受體，當(dāng)FSH與位于靶細(xì)胞膜上的FSH受體結(jié)合后，激發(fā)cAMP信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活目的基因表達(dá)，激活芳香化酶，引起類固醇蛋白如孕酮、雌二醇等的合成和分泌。

已有多種人顆粒細(xì)胞系被建立用于研究和應(yīng)用，例如來源于卵巢腫瘤細(xì)胞的HTOG、COV434和KGN細(xì)胞系，通過致癌性轉(zhuǎn)化的HGL、HO-23、GCLa、HGP53細(xì)胞系[11]。KGN細(xì)胞株是從一位患有顆粒細(xì)胞癌的婦女身上獲得的，在FSH受體的表達(dá)上表現(xiàn)出良好的生理活性。KGN細(xì)胞產(chǎn)生孕酮的量與FSH的加入呈一定的劑量反應(yīng)關(guān)系[12]，據(jù)此，我們建立了一種FSH的體外生物學(xué)活性測定方法，用不同濃度的FSH作用于KGN細(xì)胞，使細(xì)胞的孕酮分泌相應(yīng)增加，采用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中孕酮含量的增加程度，以此反映FSH的生物學(xué)活性，無須任何改造，簡單方便實(shí)用。

采用KGN細(xì)胞活性測定方法可同時檢測多個樣品，其結(jié)果用FSH國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。相比藥典規(guī)定的卵巢增重法，利用KGN細(xì)胞測定FSH活性的方法避免了耗時長、操作繁瑣、重復(fù)性差的限制，評價結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度均有大幅度提高，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)和檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料

KGN細(xì)胞系由解放軍總醫(yī)院母義明教授贈送；已上市的CHO細(xì)胞表達(dá)的重組人FSH產(chǎn)品果納芬（Gonal-f）購自默克雪蘭諾有限公司（批號BAO21064、BAO20708、BAO22155，13.6 IU/μg）；自制 重 組 人 FSH（ 批 號 R6008DS01、R6009DS01、R6010DS01）；第二代FSH活性測定用國際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC code為 08/282，12.6 IU/μg）購自英國國家生物制品檢定所（NIBSC）；活性測定用尿促性素國家標(biāo)準(zhǔn)品（150524-200503，190 IU/支）購自中國藥品食品檢定研究院。

DMEM/F12培養(yǎng)基購自Life Technology公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；青鏈霉素、胰蛋白酶、PBS緩沖液、0.4%臺盼藍(lán)染色液均購自Sigma公司；孕酮檢測ELISA試劑盒分別購自Alpha Diagnos?tic公司和DRG公司；酶標(biāo)儀和SoftMax分析軟件為Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞懸液和FSH樣品制備

KGN細(xì)胞為單層貼壁生長細(xì)胞，生長用培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM/F12，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3～4 d，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后可用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞用0.25%胰酶消化2～3 min后棄去胰酶，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，臺盼藍(lán)染色法，在顯微鏡下用血球細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，即2×104/孔，24 h后更換為含1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，然后用含1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基對FSH樣品進(jìn)行1∶3系列稀釋，共8個稀釋度，將稀釋好的樣品加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，每個樣品2個復(fù)孔，于37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后檢測。

1.3 孕酮含量檢測

待FSH作用細(xì)胞不同時間后，用DRG公司生產(chǎn)的孕酮含量檢測ELISA試劑盒（D450nm的線性范圍為0～2.5）檢測各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清中的孕酮含量：分別取各孔細(xì)胞上清25 μL，轉(zhuǎn)移至已包被好的ELISA板中，同時每板中加入試劑盒提供的孕酮標(biāo)準(zhǔn)品，室溫下?lián)u床孵育5 min，每孔加入200 μL酶聯(lián)抗體，室溫下?lián)u床孵育1 h，棄去各孔液體，用洗液清洗各孔，每孔300 μL，重復(fù)清洗3次，每孔加入200 μL顯色溶液，室溫下反應(yīng)15 min，每孔加入50 μL終止液終止顯色，用酶標(biāo)儀測定D450nm值，并利用SoftMax軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計算和分析，制作孕酮標(biāo)準(zhǔn)品曲線，分別計算不同F(xiàn)SH濃度作用下各孔的孕酮含量。

1.4 采用FSH國際標(biāo)準(zhǔn)品確定樣品的活性單位

利用SoftMax軟件，以國際標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的D450nm值為縱坐標(biāo)，繪制國際標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的劑量-反應(yīng)曲線，采用四參數(shù)方程進(jìn)行擬合，分別計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的EC50值，用國際標(biāo)準(zhǔn)品的活性對樣品活性按下式進(jìn)行校正：

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證和多批次樣品檢測

對建立的方法的專屬性、線性與范圍、準(zhǔn)確性、精密度和耐受性進(jìn)行驗(yàn)證，采用該方法對多批次FSH產(chǎn)品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 最佳作用時間和濃度的確定

不同濃度的FSH作用KGN細(xì)胞24、48、72、96 h后檢測細(xì)胞的孕酮含量，結(jié)果見圖1。在不同濃度的FSH作用下，KGN細(xì)胞分泌出不同濃度的孕酮，F(xiàn)SH濃度為0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞的孕酮分泌量與FSH濃度呈明顯的劑量相關(guān)性。隨著作用時間的延長，相同濃度FSH作用下KGN細(xì)胞的孕酮分泌量逐漸升高，高濃度FSH作用24、48、72、96 h時，誘導(dǎo) KGN細(xì)胞分泌的孕酮量分別為0.4、11.2、96.8和112.5 ng/mL，與培養(yǎng)基對照組相比，孕酮分泌量分別提高了約0.4、10、100和110倍。各濃度FSH作用24 h時細(xì)胞基本無孕酮分泌，高濃度FSH作用48 h后顯示孕酮含量增加，但幅度不明顯，作用72 h后孕酮分泌量明顯升高，96 h與72 h相比孕酮分泌量也略有升高。

以FSH濃度為橫坐標(biāo)、D450nm值為縱坐標(biāo)做圖（圖2），結(jié)果顯示作用24 h時D450nm值與陰性對照一致；高濃度FSH作用48 h后D450nm值明顯降低，但還未形成良好的S型作用曲線；各濃度FSH作用72和96 h后，D450nm值與FSH濃度形成典型的S型作用曲線。比較后可以看出，作用96與72 h相比孕酮含量并沒有明顯提高，作用曲線一致。因此，為縮短檢測時間，最終確定該方法最佳作用時間為72 h，F(xiàn)SH作用濃度為0.1～200 ng/mL。

2.2 樣品檢測并采用FSH國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定

對市售重組FSH（默克雪蘭諾有限公司）采用最終確定的方法進(jìn)行檢測，選用對數(shù)生長期KGN細(xì)胞，檢測結(jié)果（表1）與該市售樣品的標(biāo)示量（13.6 IU/μg）一致。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性 FSH產(chǎn)品中含有一定濃度的輔料，因此考察輔料成分對KGN細(xì)胞是否有刺激作用。用超純水配制不含F(xiàn)SH的輔料溶液，然后按同樣方法分別稀釋輔料溶液和FSH蛋白溶液，作用KGN細(xì)胞72 h后檢測孕酮含量。結(jié)果顯示各稀釋率下輔料D450nm值均與陰性對照一致（圖3），說明輔料對KGN細(xì)胞無刺激作用，對結(jié)果不產(chǎn)生影響。

2.3.2 線性與范圍 國際標(biāo)準(zhǔn)品、市售重組FSH（批號：BAO21064）和自制樣品（批號：R6008DS01）在FSH為0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)均存在良好的劑量反應(yīng)曲線，且符合四參數(shù)方程式（表2），呈典型的倒S型，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。國際標(biāo)準(zhǔn)品和FSH樣品的劑量反應(yīng)曲線見圖4，其相關(guān)系數(shù)分別為0.994、0.996和0.998，三者作用曲線重合，說明3種FSH樣品的量效作用關(guān)系一致，屬于同質(zhì)樣品，其活性結(jié)果可以用國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。

表1 市售樣品檢測結(jié)果

圖1 FSH作用不同時間孕酮分泌量比較

圖2 FSH作用不同時間作用曲線比較

2.3.3 準(zhǔn) 確 性 試 驗(yàn) FSH自 制 樣 品（批 號 ：R6008DS01）與國際標(biāo)準(zhǔn)品按一定比例混合，分別制成50%、100%、150%添加的回收率樣品，進(jìn)行活性測定，并與標(biāo)準(zhǔn)品理論添加值進(jìn)行比較，每個樣品重復(fù)測定3次。結(jié)果見表3，各樣品的回收率為86%～114%（表3），符合生物學(xué)活性測定的回收率要求。

2.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 對3批市售FSH樣品和3批自制FSH樣品分別重復(fù)測定3次，計算變異系數(shù)，其比活性平均值為12.9～14.3 IU/μg（表 4），其變異系數(shù)均小于15%。

2.3.5 耐用性試驗(yàn) 市售有不同廠家的孕酮檢測試劑盒，檢測原理基本相同，但檢測靈敏度會有所不同。選用較常用的2個廠家的孕酮檢測ELISA試劑盒（分別為Alpha Diagnostic公司和DRG公司產(chǎn)品）進(jìn)行試驗(yàn)，這2種試劑盒檢測原理相同，但說明書顯示其檢測靈敏度和吸光度值范圍有所差異。結(jié)果顯示，在同樣濃度條件下，Alpha Diagnostic公司試劑盒測定的D450nm值為0.2～1.174，DRG公司的則為0.3～1.90（圖5），二者的檢測靈敏度存在一定差異，但劑量反應(yīng)曲線非常一致（圖6），EC50值一致。經(jīng)國際標(biāo)準(zhǔn)品校正，得出的結(jié)果顯示2種試劑盒檢測活性一致（表5），說明該方法對不同品牌的試劑盒有很好的耐用性。

表2 FSH活性測定四參數(shù)方程

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 與大鼠卵巢增重法測定結(jié)果比較

選擇3批市售果納芬樣品和1批尿源FSH國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行活性測定，并與傳統(tǒng)方法（大鼠卵巢增重法）測定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)KGN細(xì)胞活性測定結(jié)果與卵巢增重法測定結(jié)果一致（表6、7）。

3 討論

如同促紅細(xì)胞生成素、人體絨毛膜促性腺激素和人類促黃體生成素，F(xiàn)SH仍是為數(shù)不多的需要體內(nèi)活性測定方法的蛋白質(zhì)。惟一被國內(nèi)外相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的體內(nèi)活性檢測方法仍是在1953年建立的大鼠卵巢增重法。該方法有很大的局限性，包括須使用大量動物，試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性、精密度，以及較復(fù)雜的結(jié)果計算方法。此外，有研究表明FSH在其他哺乳動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為與在大鼠體內(nèi)存在差異，因此采用大鼠卵巢增重法進(jìn)行FSH生物學(xué)活性評價可能存在種屬上的差異[13]。

圖3 專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（輔料影響）

圖4 四參數(shù)劑量反應(yīng)曲線

為避免該方法的缺陷，近年嘗試采用一些理化方法如凝膠排阻層析法、等點(diǎn)聚焦法及反相色譜法等[8-10]代替體內(nèi)測定方法，但這些方法都不能很好地反映生物學(xué)活性，其結(jié)果必須與幾十批產(chǎn)品的體內(nèi)活性結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。此外，這些理化分析方法對樣品的純度要求很高，其結(jié)果與產(chǎn)品的不同工藝相關(guān)，所以通用性不是很好。

本研究建立的KGN細(xì)胞體外生物活性測定法可以克服上述體內(nèi)活性測定方法和理化方法的局限性。KGN細(xì)胞來源于人，天然表達(dá)FSH受體，不需要進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染等修飾[11]。KGN細(xì)胞經(jīng)不同濃度的FSH刺激后產(chǎn)生的孕酮分泌量的變化可以通過商用的孕酮檢測ELISA試劑盒進(jìn)行測定。與體內(nèi)測定法相同，該方法在檢測時可以使用活性測定用FSH國際標(biāo)準(zhǔn)品（92/642或08/282）對結(jié)果進(jìn)行校正[14]。而對于色譜法等理化測定方法，由于該國際標(biāo)準(zhǔn)品輔料中含有大量人血清白蛋白而對結(jié)果產(chǎn)生干擾，所以不能用于理化測定方法的校正。與體內(nèi)活性測定法相比，KGN細(xì)胞檢測法需要的FSH蛋白劑量范圍更寬，為0.1～200 ng/mL。經(jīng)過完整的方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法對FSH有很好的專屬性，并且不受樣品中輔料物質(zhì)的干擾；在一定的濃度范圍內(nèi)有很好的劑量-反應(yīng)相關(guān)作用曲線，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為80%～120%，精密度試驗(yàn)的變異系數(shù)在15%以內(nèi)，對于生物活性測定方法來說有很高的準(zhǔn)確度和精密度；孕酮含量檢測考察了2種品牌的商用ELISA試劑盒，雖然有不同的靈敏度，但對結(jié)果的測定和計算沒有明顯差異，表現(xiàn)了很好的耐用性。該方法使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行檢測，可同時進(jìn)行多個樣品的檢測，與體內(nèi)活性檢測方法相比，可以大大提高檢測效率，同時可顯著降低檢測成本。更重要的是，與理化測定方法不同，KGN細(xì)胞活性測定法對CHO細(xì)胞表達(dá)的重組人FSH和尿源FSH產(chǎn)品都有很好的適用性，其結(jié)果與體內(nèi)活性測定一致。綜上所述，這種KGN細(xì)胞體外活性測定法可以對FSH的生物學(xué)活性進(jìn)行很好的評價，其結(jié)果可以對臨床試驗(yàn)進(jìn)行很好的預(yù)測。

表5 不同品牌試劑盒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 與卵巢增重法結(jié)果比較（果納芬）

表7 與卵巢增重法結(jié)果比較（尿源國家標(biāo)準(zhǔn)品）

國內(nèi)外藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)一直鼓勵開發(fā)新的分析方法代替動物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行生物活性分析[15]，但是像FSH這樣的激素類糖蛋白，由于其結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，開發(fā)一種體外活性測定方法來代替動物實(shí)驗(yàn)方法確實(shí)存在很大的挑戰(zhàn)性。FSH的不同唾液酸化程度受上游細(xì)胞培養(yǎng)條件的影響很大，導(dǎo)致產(chǎn)生很多不同的糖型結(jié)構(gòu)[13,16]。這些不同的結(jié)構(gòu)亞型在體內(nèi)表現(xiàn)了不同的藥代動力學(xué)結(jié)果，例如不同的唾液酸化程度其在體內(nèi)的半衰期有很大的不同[17]。本研究開發(fā)的基于KGN細(xì)胞的體外活性測定方法可以區(qū)分不同的結(jié)構(gòu)特征。KGN顆粒細(xì)胞系是一個很好的FSH體外作用模型，細(xì)胞表面具有天然的FSH受體，無須進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染等改造。FSH作用于KGN細(xì)胞，使其產(chǎn)生孕酮，其產(chǎn)生量與FSH濃度具有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，可以很好地反映FSH在體內(nèi)的生物學(xué)活性。綜上所述，KGN細(xì)胞體外測定方法有諸多優(yōu)勢，有望在將來代替現(xiàn)有的體內(nèi)活性測定方法，對FSH產(chǎn)品進(jìn)行生物學(xué)活性評價，更易于對FSH產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制和一致性比較。

圖5 不同品牌孕酮檢測試劑盒吸光度值比較

圖6 不同品牌孕酮檢測試劑盒作用曲線比較

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