趙楠，韓鳳娟，王桂媛，李玉花

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

順鉑是中心以二價鉑同2 個氯原子和2 個氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，具有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用，可抑制DNA的復(fù)制過程，高濃度時抑制RNA及蛋白質(zhì)合成。臨床上順鉑可以與多種抗腫瘤藥協(xié)同作用，且無交叉耐藥特點，為當(dāng)前聯(lián)合化療中最常用的藥物之一，一般多用于生殖系統(tǒng)腫瘤如卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌，頭頸部癌如鼻咽癌、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌，對肺癌、乳腺癌等也有一定的功效。鴉膽子油乳由中藥鴉膽子［Brucea javanica（L.）Merr.］干燥的成熟果實提取的脂肪油經(jīng)乳化作用制成，其主要活性成分油酸及亞油酸具有很強(qiáng)的抗癌活性，與腫瘤細(xì)胞膜有特異的親和力[1]，能抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成。研究表明，鴉膽子油乳作為臨床應(yīng)用較廣的一種中藥，對多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有誘導(dǎo)凋亡的作用，并可逆轉(zhuǎn)多種癌細(xì)胞的多藥耐藥，臨床上多采用鴉膽子油乳作為逆轉(zhuǎn)劑與常用抗癌藥合用治療產(chǎn)生耐藥性的腫瘤。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c（nu/nu）裸小鼠，雌性，鼠齡4～8 周，體重18～22 g，SPF 級，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［合格證號：11400700054740］，恒溫（25℃±2℃）、恒濕（45%～50%）飼養(yǎng)于無菌實驗室的凈化空氣層流架中。人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞株購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院；鴉膽子油乳劑購自浙江九旭藥業(yè)公司，10 mL/支；順鉑購自山東齊魯制藥廠，50 mL/支；新生胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自Sigma 公司；二甲亞颯（DMSO）購自北京化學(xué)試劑廠；DAB 顯色試劑盒、兔抗人整合素α5、MRP-1/CD9免疫組化試劑盒、免疫組化SP 試劑盒均購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 人卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng)

人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，在98%相對濕度、37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。常規(guī)消化收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，讀出細(xì)胞濃度，將細(xì)胞分裝入離心管，12 000 r/min 離心5 min，去其上清液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為（1～3）×107/mL。

1.3 腫瘤動物模型的建立

常規(guī)消毒裸鼠，將濃度為1×107/mL 的SKOV3 細(xì)胞0.2 mL 注射于裸鼠后背部皮下，待接種成功的原代接種瘤生長至直徑1～1.5 cm，頸椎脫臼法處死裸鼠，剝?nèi)∑は履[瘤浸入4℃的生理鹽水中漂洗，并切成1 mm3大小。常規(guī)麻醉、消毒裸鼠，將準(zhǔn)備好的皮下腫瘤組織小塊小心放置在卵巢破口深處，滴注適量醫(yī)用生物蛋白膠固定，觀察有無出血，逐層關(guān)腹。

1.4 動物給藥及處理

裸鼠接種2 周后，測得裸鼠的體重為18～24 g，給予藥物干預(yù)。用隨機(jī)數(shù)字表將32 只裸鼠完全隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為空白對照組、鴉膽子油乳組、順鉑組和鴉膽子油乳順鉑聯(lián)合組?？瞻讓φ战M給予生理鹽水0.2 mL/只，鴉膽子油乳組給予鴉膽子油乳0.2 mL/20 g，順鉑組給予順鉑0.2 mL（按3 mg/kg計算），聯(lián)合組給予鴉膽子油乳注射液0.2 mL/20 g 加順鉑0.2 mL。每隔3 d 給藥1 次，共計腹腔給藥6次。

1.5 實驗觀察指標(biāo)

1.5.1 移植瘤裸鼠生長情況 每日觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動、飲食、排便、對外界的反應(yīng)等，以及移植瘤表面有無紅腫及破潰面，其大小、形態(tài)、質(zhì)地、硬度、活動度，并觸及有無搏動。

1.5.2 移植瘤生長參數(shù)測定 ①腫瘤體積測量：移植瘤裸鼠處死后剝瘤塊取出腫瘤組織，電子天平稱重，并用游標(biāo)卡尺測量瘤體最長徑（a/mm）與最短徑（b/mm），根據(jù)公式V=ab2/2計算腫瘤體積。②腫瘤抑制率檢測：腫瘤抑瘤率（%）=（1-治療組腫瘤組織平均重量/空白組腫瘤組織平均重量）×100%。③相對腫瘤增殖率（T/C）的計算：相對腫瘤增殖率（T/C）=（TRTV/CRTV）×100%。TRTV 為治療組相對腫瘤體積，CRTV為陰性對照組相對腫瘤體積，RTV（相對腫瘤體積）=V/V0（V0為給藥前腫瘤體積，V為處死前腫瘤體積）。療效評價標(biāo)準(zhǔn)：T/C＞60%為無效；T/C≤60%，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P＜0.05為有效。

1.5.3 血細(xì)胞指標(biāo)檢測 末次給藥后將各組裸鼠眼眶取血后處死，收集血液于EP 管中，加入肝素抗凝劑，取300μL用血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞及血小板數(shù)目；取500μL 靜置30 min，離心取血清，檢測各組裸鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、血肌酐（CR）的變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用x±s 表示，進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性分析，兩組間均數(shù)使用獨立樣本t檢驗，兩組用藥前后使用配對t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用多重比較LSD 法。以α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05 視為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SKOV3裸鼠移植瘤模型的建立

觀察發(fā)現(xiàn)，一般接種2～3 d 后裸鼠后背即可出現(xiàn)界限清晰、質(zhì)地柔軟的“假瘤樣”皮下結(jié)節(jié)；1～2 周后部分移植瘤表面出現(xiàn)破潰，部分可見血管；當(dāng)移植瘤直徑達(dá)1.5 cm 后，腫瘤生長速度逐漸減慢，裸鼠精神萎靡、消瘦、厭食、怕光、煩躁，一般生存期為37～42 d。

2.2 卵巢癌SKOV3原位腫瘤的形成

移植原位腫瘤后常規(guī)飼養(yǎng)裸鼠。一般可見，移植28 d 后原位腫瘤生長速度減慢，荷瘤鼠逐漸表現(xiàn)出消瘦、萎靡、厭食等癥狀。剖腹探查原位腫瘤的形成，發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑為1.0～2.0 cm，有1 只發(fā)生腸系膜腹腔轉(zhuǎn)移。見圖1。

2.3 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響

給藥前各組裸鼠腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。隨著治療天數(shù)的增加，治療結(jié)束后，各組裸鼠腫瘤體積產(chǎn)生明顯差異，各治療組與對照組相比差異顯著（P＜0.01），說明鴉膽子油乳組、順鉑組、聯(lián)合組均可有效遏制腫瘤細(xì)胞生長（表1）。

2.4 不同藥物對SKOV3 裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較

鴉膽子油乳組、順鉑組、聯(lián)合組的抑瘤率分別為23.56%±3.67%、42.57%±3.45%、48.36%±3.08%，聯(lián)合組的抑瘤率明顯高于鴉膽子油乳組和順鉑組，可以有效遏制腫瘤組織的生長（表2）。

2.5 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤體積、RTV 與T/C的影響

腹腔注射給藥后，鴉膽子油乳組、順鉑組與聯(lián)合組腫瘤體積、RTV和T/C 明顯下降，T/C 均低于60%，根據(jù)抗腫瘤藥效學(xué)指導(dǎo)原則中的療效評價標(biāo)準(zhǔn)，揭示其體內(nèi)抗腫瘤活性較強(qiáng)，且與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

2.6 不同藥物對SKOV3 裸鼠白細(xì)胞及血小板的影響

通過檢測裸鼠血小板和白細(xì)胞數(shù)量來觀察各治療組的變化，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，鴉膽子油乳組血小板、白細(xì)胞數(shù)量均減少，其中血小板的減少差異不顯著（P＞0.05），而白細(xì)胞數(shù)量減少的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而順鉑組、聯(lián)合組的血小板、白細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表4）。

2.7 不同藥物對SKOV3裸鼠肝腎功能的影響

與空白對照組比較，鴉膽子油乳組治療后裸鼠ALT 值無顯著差異，不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），LDH、CR 值差異顯著（P＜0.01）；與鴉膽子油乳組比較，順鉑組與聯(lián)合組的ALT、LDH、CR 值均有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表5）。

表1 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響（n=8，）

表1 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響（n=8，）

表2 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較（n=8，）

表2 不同藥物對SKOV3裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較（n=8，）

表3 不同給藥組裸鼠瘤體積的RTV及T/C值（n=8，）

表3 不同給藥組裸鼠瘤體積的RTV及T/C值（n=8，）

圖1 原位腫瘤的形成（A）、形態(tài)（B）、大?。–）、正面形態(tài)（D）及腸系膜轉(zhuǎn)移（E）

表4 不同藥物對SK0V3裸鼠白細(xì)胞及血小板的影響（n=8，）

表4 不同藥物對SK0V3裸鼠白細(xì)胞及血小板的影響（n=8，）

表5 不同藥物對SKOV3裸鼠肝腎功能的影響（n=8，）

表5 不同藥物對SKOV3裸鼠肝腎功能的影響（n=8，）

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率居于婦科惡性腫瘤第三位，死亡率居于婦科惡性腫瘤之首,五年生存率為15%～30%[2-3]，嚴(yán)重威脅著女性健康及生命。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)、鉑類化療藥物和紫杉醇聯(lián)合化療的綜合治療，仍是目前臨床上治療卵巢癌的主要方式。上世紀(jì)60 年代開始采用腹腔灌注化療治療卵巢癌，主要針對患者術(shù)后殘余及腹腔轉(zhuǎn)移的病灶進(jìn)行治療，可以有效清除游離癌細(xì)胞及微小癌灶，防治術(shù)后腹腔復(fù)發(fā)及肝臟轉(zhuǎn)移，提高患者生存率，改善生存質(zhì)量。

我們的前期體外實驗研究已證實鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑可以抑制人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡。隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，細(xì)胞生長抑制率呈上升趨勢。在此基礎(chǔ)上，我們將體外實驗引入體內(nèi)，將腫瘤細(xì)胞懸液皮下注射成瘤后，取成型的皮下腫瘤進(jìn)行組織塊原位移植，建立人卵巢癌裸鼠原位移植瘤模型，分組給予藥物干預(yù)，進(jìn)一步觀察鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響。

3.1 人卵巢癌SKOV3裸鼠原位移植瘤模型的建立

自1969年丹麥學(xué)者Rygaard和Povlsen首次建立了人結(jié)腸癌組織裸鼠皮下移植瘤模型后，裸鼠移植瘤模型實驗技術(shù)日臻完善。裸鼠移植瘤模型成為探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、檢測抗腫瘤藥物的敏感性、研發(fā)新型抗腫瘤藥物的有效實驗手段[4]。卵巢癌裸鼠移植瘤模型按腫瘤的來源不同，可以分為切除標(biāo)本實體瘤和卵巢癌細(xì)胞株；按接種部位的不同，可以分為皮下移植裸鼠模型、腹腔種植裸鼠模型和裸鼠體內(nèi)原位移植模型[5]。

1993 年Fidler 建立了第一個人卵巢癌原位移植模型，該方法保留了人腫瘤的遺傳學(xué)及卵巢原發(fā)瘤灶、局部浸潤、對側(cè)卵巢轉(zhuǎn)移、腹腔大網(wǎng)膜和臟器表面種植、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水形成等卵巢癌的生物學(xué)特性[6-7]，能夠更客觀、真實地反映人卵巢癌的臨床發(fā)展過程。手術(shù)切除標(biāo)本實體瘤模型病例結(jié)構(gòu)更接近人卵巢癌，但建模時間長、難度大，成功率多為28%～40%[8-9]，而細(xì)胞株建立模型的原代移植成功率則高達(dá)90%，腫瘤組織塊鼠間傳代的移植成功率高達(dá)100%[10]。所以，采用腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)后建模的方法較為理想。

我們通過將人體腫瘤細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠BALB/c（nu/nu）體內(nèi)的移植方法，建立了人卵巢癌SKOV3 裸鼠原位移植瘤模型。該模型成瘤率高且穩(wěn)定，實驗周期短，干預(yù)措施易于實施，且樣本的均一性及實驗結(jié)果的重復(fù)性較為客觀，樣本脫落少，更能準(zhǔn)確真實地反映腫瘤在體內(nèi)的發(fā)生演變過程。

3.2 鴉膽子油乳聯(lián)合順鉑腹腔給藥治療卵巢癌的療效性分析

中藥鴉膽子油乳注射液是由鴉膽子干燥的成熟果實提取的脂肪油經(jīng)乳化作用制成的水包油型乳劑，具有抗癌活性的油酸及亞油酸是其主要活性成分，并且可以與腫瘤細(xì)胞膜發(fā)生細(xì)胞特異性親和。鴉膽子油乳的有效成分具有細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的DNA 合成，使腫瘤細(xì)胞變性、破裂、壞死，同時作用于機(jī)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，改善細(xì)胞免疫狀態(tài)。這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。鴉膽子油乳主要通過質(zhì)膜系統(tǒng)和線粒體系統(tǒng)直接殺傷癌細(xì)胞，其活性成分不飽和脂肪酸可以通過降低腫瘤細(xì)胞的-SH 基含量，使細(xì)胞膜變薄，從而增加對抗癌藥物的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，有利于抗癌藥物的滲透。因此，在臨床上多采用鴉膽子油乳與常用抗癌藥聯(lián)合放化療治療腫瘤。

1978 年美國首先批準(zhǔn)臨床采用順鉑治療腫瘤，其具有高效廣譜抗癌的特點，抗腫瘤主要機(jī)制是可與腫瘤細(xì)胞DNA 結(jié)合，并破壞DNA 功能，阻斷其復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長受到抑制[11]。此外，順鉑還參與腫瘤細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、水合解離、靶向遷移[12]，均與其抗腫瘤效應(yīng)相關(guān)。臨床上順鉑聯(lián)合化療仍是目前應(yīng)用廣泛的治療方案，其在提高患者生存率的同時，也存在一定的毒性作用[13]。順鉑一般容易引起消化道反應(yīng)、骨髓抑制、腎毒性、耳毒性及周圍神經(jīng)毒性等副反應(yīng)。

我們通過測量裸鼠移植瘤體積、抑瘤率等，發(fā)現(xiàn)鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑對SKOV3 移植瘤的生長具有抑制作用；檢測裸鼠白細(xì)胞、血小板數(shù)目及肝腎功能的改變，顯示鴉膽子油乳相對于順鉑對人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞裸鼠白細(xì)胞及血小板、肝腎功能（ALT、LDH、CR）的影響較小，具有低毒作用，在一定程度上可以避免順鉑化療藥物所致的不良反應(yīng)，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。

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