羅陽 李莉 林戈

摘要：選定多個階段小鼠卵巢進行切片染色和生殖細胞計數(shù)統(tǒng)計等分析，以發(fā)現(xiàn)該階段小鼠卵巢的發(fā)育特點結(jié)果顯示在胚胎發(fā)育第12.5d的生殖嵴中，大部分的生殖細胞正進行有絲分裂增殖，并以生殖包囊的形式存在；在出生后第2d的小鼠卵巢中，有大量緊密接觸的原始卵泡，表明生殖包囊剛完成重組形成原始卵泡；在第5d的小鼠卵巢中，原始卵泡仍占有大部分比例，但也有大量的初級卵泡處于發(fā)育之中；在出生后第10d的卵巢中同時有原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡的發(fā)育；老年小鼠（16個月大）卵巢中已基本沒有卵母細胞.，

關(guān)鍵詞：卵巢發(fā)育；生殖嵴；生殖包囊；卵泡

中圖分類號：Q418；Q95-3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號=1007-7847（2015）01-0044-05

PreliminaryStudiesofSeveralImportantDevelopmentalEventsinMouseOvary

LUOYang1，LILi1，LINGe2*

（1.CenterforReproductiveMedicine，ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity；KeyLaboratoryforRepro?ductiveMedicineofGuangdongProvince，Guangzhou510150，Guangdong，China；InstituteofReproductiveandStemCellEngineering，CentralSouthUniversity，ChangshaReproductiveandGeneticHospitalofCitic-Xiangya，Changsha410078，Hunan，China）

Abstract：Ovariesfrommiceatselectedstageswerestainingandcountingstatistics，todiscovertheirdevelo?pmentalcharacteristics.Theresultsindicatedthatmostofthegermcellswereproliferatingandexistingintheformofgermcystsinfemalegonadofembryodays12.5；Theday2ovarieshadmanyadjacentandclosedcontactedprimordialfollicles，whichindicatedthatthegermcellcystsjustcompletedtheprogrammedbreakdowntoformprimordialfollicles；Intheday5ovaries，therewerealargenumberofprimaryfollicles，hutprimordialfolliclesstilloccupiedmostly；Theday10ovarieshadthedevelopingprimordial，primaryandsecondaryfolliclesatthesametime；Theagedmouseovaries（16monthsold）almostpossessednooocytes.

Keywords：ovariandevelopment；genitalridge；germ

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：044?048）

由于哺乳動物生殖發(fā)育的保守性，人類卵巢發(fā)育的許多線索通常是先通過對小鼠卵巢發(fā)育的研究來獲得的[1-3]。本文通過對基本貫穿小鼠生命周期的幾個卵巢發(fā)育重要事件的研究，為小鼠卵巢發(fā)育乃至人類卵巢的相關(guān)研究提供一定的借鑒。

1材料與方法

1.1實驗動物

C57bl/6j小鼠購自湖南斯萊克景達動物有限公司（中科院上海實驗動物中心湖南分中心）。小鼠飼養(yǎng)條件為恒定溫度下，12h的光照和12h的黑暗，提供充足的水和動物飼料；

孕鼠的獲得：適育年齡的母鼠（8周左右），于下午2點左右進行孕馬血清血促性素注射，48h后進行絨促性素注射，然后與適育年齡的公鼠（10周左右）以2：1進行同籠，次日早晨進行檢栓，見栓小鼠以當(dāng)日中午起記為第0.5d。所有小鼠的處死均采用頸椎脫位法殺死。

1.2主要實驗試劑與儀器

注射用血促性素（孕馬血清）和注射用絨促性素由浙江杭州動物藥品廠提供；DPBS（Dulbeccosphosphate-bufferedsaline）、胎牛血清、Edu及相應(yīng)檢測試劑由美國Invitrogen公司提供；生殖細胞特異性標(biāo)記MVH多克隆抗體及相應(yīng)二抗由美國R&D公司提供；體視顯微鏡（SM2645）、倒置顯微鏡（TE300）以及免疫突光顯微鏡由日本Nikon公司提供。

1.3實驗方法

1.3.1胚胎期第12.5d（E12.5）生殖嵴組織的取材及石蠟包埋

E12.5生殖嵴組織的取材為懷孕第12.5d的母鼠處死后，剝離取出胚胎置于100mm皿中，于體視鏡下解剖取雌性生殖嵴組織。由于E12.5的生殖嵴組織需要進行細胞增殖檢測實驗，故需要在處死前進行Edu注射。具體方法為對懷孕第12.5d的孕鼠注射Edu溶液，3h后進行第2次注射，待3h后進行處死取材。

小鼠胚胎浸潤于冰冷（4℃）DPBS中，洗滌去除血污，用細剪刀自上肢下方處剪除去掉胚胎的上部組織，保留下半部分胚胎；以鐘表鑷沿下半部胚胎的腹部中間夾開，挑出腹部的肝臟和腸子等雜質(zhì)組織，后轉(zhuǎn)至另一潔凈的操作皿中，用冰冷DPBS沖洗干凈后，用鐘表鑷輕柔地固定胚胎兩側(cè)，分離挑出胚胎體腹后壁兩側(cè)的雌性生殖嵴組織。鏡下可從組織形態(tài)區(qū)別生殖嵴組織的性別：雄性生殖嵴組織相對粗而短，可見有分布于組織中的條紋；雌性生殖嵴組織相對細而長，可見有分布于組織中的斑點存在[4、5]。

取出的生殖嵴組織直接投入含有4%多聚甲醛的1.5mL的EP管中進行固定，置于4℃固定過夜。第二天用鑷子取出固定好的生殖嵴組織，以包埋紙包裹好組織，然后進行組織石蠟包埋。

1.3.2第2d、5d、10d及老年期小鼠卵巢石蠟組織的制備

分別取出生后第2d、5d、10d小鼠，處死后，于顯微鏡下取出其卵巢組織，取出的卵巢組織以4%多聚甲醛固定，4℃過夜。第二天進行組織石蠟包埋。

由于老年小鼠卵巢組織需要進行細胞增殖檢測實驗，故需要在處死前進行Edu注射，具體方法同E12.5生殖嵴組織中操作。老年小鼠處死后，取出其卵巢組織，4℃固定過夜。第二天進行組織石蠟包埋。

1.3.3卵巢石蠟組織切片Edu免疫熒光染色及檢測

Edu染色作為一種檢測細胞有絲分裂的簡便和有效方式，廣泛用于細胞增殖的檢測研究[6]。本研究中通過對活體小鼠進行Edu注射后，取其卵巢組織進行免疫熒光染色，以檢測研究組織細胞的增殖狀況。

制備的石蠟組織行4pm切片，然后進行抗原修復(fù)。實驗時配置Edu染色液，吹打混勻后，避光反應(yīng)30min，吸去反應(yīng)液后，可直接于熒光顯微鏡下進行觀察或繼續(xù)進行其他免疫熒光染色

1.3.4卵巢石蠟組織切片MVH免疫焚光染色及檢測

是僅特異性表達于生殖細胞中的基因，其在小鼠中同系基因為MVH（mouseVasahomo-logue，MVH）[7、8]。本實驗中，將MVH作為生殖細胞的檢測標(biāo)記。

制備的石蠟組織行4μm切片，抗原修復(fù)后，胎牛血清封閉液封閉處理30min，吸去封閉液，加入以封閉液稀釋的一抗MVH，濃度為8mg/L，置于4℃下孵育過夜；第二天，取出孵育的切片，于室溫下復(fù)溫30min，然后漂洗液漂洗5minx2次，加入稀釋過的熒光二抗（1：1000），室溫下避光孵育1h，吸去二抗，以漂洗液漂洗10minx3次，加入Dapi，避光10min，吸去Dapi，漂洗5minx2次后，于熒光顯微鏡下進行免疫熒光觀察

1.3.5組織學(xué)觀察和評價

將實驗中的卵巢組織進行石蠟包埋和切片，HE染色后于高倍鏡下進行評價和計數(shù)分析。卵泡分析參照Tilly等運用的標(biāo)準，即由單層扁平的小顆粒細胞包繞著初級卵母細胞時稱之為原始卵泡[1、9]；由單層立方柱狀顆粒細胞包繞初級卵母細胞時為初級卵泡；多于兩層少于四層立方狀顆粒細胞包繞卵母細胞的卵泡為次級卵泡。

1.3.6數(shù)據(jù)分析處理

計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準差表示，用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2.1生殖嵴期時的生殖細胞増殖事件

我們對懷孕第12.5d時的母鼠進行Edu活體注射后處死，解剖分離出胎鼠的生殖嵴組織，發(fā)現(xiàn)不同性別胎鼠的生殖嵴組織巳有較明顯的組織學(xué)區(qū)別。雄性生殖嵴可見彎曲管狀結(jié)構(gòu)，而雌性則出現(xiàn)斑點狀特點（圖1）：對分離得到的雌性生殖嵴組織進行免疫熒光染色（EDUWMVH免疫熒光染色）（圖2），發(fā)現(xiàn)大量的生殖細胞（圖2A）處于有絲分裂狀態(tài)（圖2B），經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)雌性小鼠中處于增殖狀態(tài)的生殖細胞比例為83.14±5.2%（MVH與EDU雙陽性細胞占MVH陽性細胞的比例。（圖2C），故可認為此生殖嵴期的組織中有大部分生殖細胞處于增殖狀態(tài)。

2.2生殖包囊細胞重組形成卵泡事件

在出生后2d的小鼠卵巢組織中，基本上已見不到生殖嵴組織中那樣的生殖包囊，MVH染色發(fā)現(xiàn)大部分生殖細胞都呈現(xiàn)有完整邊界的獨立形態(tài)，但可見有較多的位置相鄰較近的原始卵泡；而且相較于生殖嵴期，2d時卵巢組織的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化我們推測該時期剛由上個發(fā)育階段中的生殖包囊完成重組形成原始生殖細胞。

對生殖包囊狀況進行計數(shù)統(tǒng)計后，發(fā)現(xiàn)生殖嵴期組織中的生殖細胞絕大部分都是以生殖包囊的形式存在，而在出生后2d小鼠卵巢組織中，則都是形態(tài)上獨立存在的原始卵泡（表1）。

2.3卵泡發(fā)育事件

在出生5d后的小鼠的卵巢組織中，生殖細胞較為均勻地分布于整個組織中，大部分都是形態(tài)是卵圓形的小卵泡（圖3）；而在10d的小鼠卵巢中，則可見有許多卵圓形的小卵泡位于組織皮層，但由組織外緣向深處也存在有較多發(fā)育相對史'為成熟的大卵泡（圖4）。經(jīng)計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，2d小鼠卵巢中卵泡均為原始卵泡；到5d時，原始卵泡比例有了明顯下降，但仍占據(jù)主要部分，此時出現(xiàn)了較多的初級卵泡，次級卵泡此時非常少；而在10d的卵巢中，原始卵泡的比例繼續(xù)顯著減少，而初級卵泡比例在上升，且此時出現(xiàn)了較多的次級卵泡（圖5）。

2.4卵泡耗竭與卵巢衰老事件

我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠（16個月大?。┥砘顒舆t鈍，毛發(fā)泛白且雜亂，同籠實驗發(fā)現(xiàn)該年齡的小鼠已不具備生育能力。卵泡計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，老年小鼠卵巢中的生殖細胞數(shù)目已非常少，表明卵巢生殖細胞儲備基本耗盡（圖6A，D）；同時，卵巢中處于增殖狀態(tài)的體細胞也很少（圖6B）。這表明該老年小鼠的卵巢已完全衰老，不能發(fā)揮相應(yīng)功能。

3討論

實驗中，發(fā)現(xiàn)生殖嵴期組織處于活躍的增殖狀態(tài)，由于生殖細胞的增殖活動僅在該期進行，所以該階段生殖細胞的增殖影響著卵巢中卵子所能達到的最大數(shù)目。

同時生殖嵴期時候生殖細胞大多以包囊形式存在，而在2日齡小鼠卵巢中，基本上均為形態(tài)獨立的卵泡細胞，表明小鼠出生前后卵巢組織中會發(fā)生大的形態(tài)變化，生殖包囊解體，與周圍體細胞重組形成卵泡。生殖細胞的數(shù)量與前階段也有一個顯著的下降，并且形成的卵泡構(gòu)成了卵巢中的卵泡儲備。至于在生殖包囊解體形成單個卵泡的過程中如何進行細胞質(zhì)的交流和細胞器的分配，以及這些活動對生殖細胞的影響則有待進一步研究[10、11]。

在2日齡小鼠卵巢中的卵泡基本上均為原始卵泡，到第5日齡卵巢中時，卵巢中出現(xiàn)一定數(shù)量的初級卵泡和少量的次級卵泡，到第10日齡時候，原始卵泡的數(shù)量顯著減少，而初級卵泡比例在上升，此時也出現(xiàn)了較多的次級卵泡。且可見原始卵泡均集中于卵巢邊緣，而初級卵泡和次級卵泡則由皮質(zhì)向髓質(zhì)呈指向分布，由此可以推測卵泡的發(fā)育存在一定的路徑選擇。

卵泡由原始卵泡募集進入發(fā)育直至排卵，直到卵泡儲備耗竭，表現(xiàn)為卵巢衰老，喪失生殖能力。實驗中我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠卵巢中已無法見到生殖細胞，且體細胞的增殖活動也處于微弱狀態(tài)[12]。

E12.5時的生殖嵴中，有大部分的生殖細胞正進行增殖，并以生殖包囊的形式存在；在出生后第2d的小鼠卵巢中，有著大量位置相鄰、接觸緊密的原始卵泡，表明生殖包囊剛完成重組形成了原始卵泡；在第5d的小鼠卵巢中，原始卵泡仍占有大部分比例，但也有大量的初級卵泡處于發(fā)育之中；在出生后第10d的卵巢中同時具有原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡的發(fā)育；而老年小鼠（16個月大?。┑穆殉仓幸鸦緵]有卵母細胞；且其體細胞的增殖活動也處于非常微弱的水平，在實際中，該時間段的小鼠喪失了生殖能力，并表現(xiàn)出明顯的衰老特征。

我們通過本實驗描述了小鼠卵巢幾個重要時期的發(fā)育事件特征，為后續(xù)的深入研究打下基礎(chǔ)。

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