孫旭紅 于曉鋒 李乃坤 杜鎮(zhèn)鎮(zhèn) 李笑 胡濤

摘要：通過(guò)研究Tn+人白血病Jurkat細(xì)胞中AChE的表達(dá)狀況，可以分析Jurkat細(xì)胞AChE表達(dá)與Tn抗原表達(dá)水平的關(guān)系，從而為AChE用于腫瘤的預(yù)后判斷或臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本論文利用ELISA、色度法試驗(yàn)在蛋白水平分析了AChE的表達(dá)狀況，利用RT-PCR以及Real-timePCR試驗(yàn)在mRNA水平分析了AChE的表達(dá)狀況結(jié)果顯示：Jurkat細(xì)胞中AChE的含量及活性明顯低于Tn-的白血病細(xì)胞K562，且二者又均低于正常白細(xì)胞由此認(rèn)為，人白血病細(xì)胞中AChE的含量及活性低于正常細(xì)胞，AChE的表達(dá)與Tn-抗原的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，為腫瘤的臨床判斷提供了有力的依據(jù).

關(guān)鍵詞：AChE；Tn抗原；腫瘤；JurkatT

中圖分類號(hào)：R730.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0034-05

StudyontheExpressionProfileofAChEinLeukimiaCellLineJurkatTWhichisTnAntigenPositive

SUNXu-hong1，YUXiao-feng1，LINai-kun2，DUZhen-zhen1，LIXiao-yan1，HUTao1"

（1.CollegeofBasicSciences，BinzhouMedicalUniversity，Yantai264003，Shandong，China；2.AffiliatedHospitalofBinzhou MedicalUniversity，Binzhou256603，Shandong，China）

Abstract：ToanalyzetherelationshipbetweentheexpressionofAChEandTnantigeninhumanleukimiacelllineJurkatTbystudyingtheexpressinglevelandactivityofacetylcholinesterase（AChE）inthesecells，whichwillprovideexperimentalevidencesaboutusingAChEtotreattumorandevaluateitsprognosis.The.studyanalyzedtheproteinactivityandcontentofAChEusingELISAandColorimetrictest，aswellasexam?inedthemRNAexpressionlevelbyRT-PCRandReal-timePCRassayinJurkatcells.TheresultsshowedthatthecontentandactivityofAChEinJurkatcells，whichwereTnantigenpositive，significantlylowerthanthatinhumanleukimiacelllineK562，whichwasTnantigennegative.Andbothofthemwerelowerthanthatinnormalwhitebloodcells.Therefore，theconclusionwasthatthecontentandactivityofAChEinhumanleukimiacellswerelowerthanthatinnormalwhitebloodcells.Therewasanegativecorrelationbe?tweentheexpressionlevelofAChEandTnantigen.Theresultswillprovidestrongsupporttodeterminetheclinicprognosisoftumor.

Keywords：AChE；Tnantigen；tumor；JurkatT

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：034～038）

乙酸膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是中樞和外周膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成成分，其經(jīng)典的生物學(xué)功能是在神經(jīng)突觸間隙滅活神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），達(dá)到終止神經(jīng)沖動(dòng)的目的。近年來(lái)的研究表明，AChE的表達(dá)并不局限于膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，在許多非神經(jīng)組織，諸入內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞以及腫瘤組織，亦有不同程度的表達(dá)[1]；并與細(xì)胞間的粘附、信號(hào)傳遞、細(xì)胞增殖分化以及細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)AChE可以通過(guò)滅活絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K/AKI），活化糖原合成激酶GSK3/3（glycogensynthesiskinase-3，GSK-3）等途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，AChE是一種新的凋亡調(diào)控因子[4]。在表達(dá)AChE的腫瘤組織中，AChE表達(dá)越高，病人預(yù)后越好；AChE甚至被認(rèn)為可以單獨(dú)作為腫瘤預(yù)后的重要標(biāo)志[5]?？乖且环N常見(jiàn)的腫瘤相關(guān)抗原，其表達(dá)水平與腫瘤組織的TNM分期有關(guān)[6、7]，與腫瘤的預(yù)后有關(guān)[8]。為徹底弄清Tn+腫瘤細(xì)胞中AChE表達(dá)狀況，本文以JurkatT、K562及正常人白細(xì)胞（whitebloodcell，WBC）為研究對(duì)象，采用ELISA、色度法檢測(cè)AChE的蛋白含量及水解活性；并提取RNA，通過(guò)RT-PCR、Real-timePCR克隆擴(kuò)增AChEcDNA，進(jìn)一步確定AChEmRNA的表達(dá)水平。分析探討AChE與Tn抗原之間的關(guān)系，進(jìn)一步明確AChE在Tn+細(xì)胞中的生物學(xué)作用。

1材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源

Tn+細(xì)胞JurkatT與Tn-細(xì)胞K562由薛江楠博士惠贈(zèng)，本室傳代保存；正常人外周血WBC作為正常對(duì)照。

1.2主要試劑

人外周血白細(xì)胞分離液（Solarbio公司，中國(guó)）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；人乙酰膽堿酯酶ELISA試劑盒（K&D，北京奇松生物科技有限公司）；anti-TnIgMMcAb為巨同忠博士惠贈(zèng)（SantaCruz公司，美國(guó)）；羊抗鼠lgM-FITC（SantaCruz公司，美國(guó)）。

1.3儀器設(shè)備

倒置顯微鏡IX-70（日本Olympus公司）；生物安全柜（上海力康公司）；冷凍離心機(jī)（ST16R，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；漩渦混合器（VWR230，美國(guó)VWR公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（TecanM1000，瑞士帝肯公司）；Real-timePCR儀（Rotor-Gene-3000，澳大利亞Corbett公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BectonDickinson公司，美國(guó)）。

1.4Tn+、Tn-細(xì)胞培養(yǎng)和正常人白細(xì)胞分離

人類T淋巴瘤細(xì)胞系JurkatT和慢性髓原白血病細(xì)胞株K562于含10%FBS的RPMI1640（Hyclone）培養(yǎng)，37°C5%CO2培養(yǎng)72h，直接收集備用。正常人5mL肝素抗凝血，按人外周血門細(xì)胞分離液試劑說(shuō)明分離白細(xì)胞，使用時(shí)用PBS懸起。

1.5超聲提總蛋白

收集3種細(xì)胞懸液，離心、棄上清，重懸于2mL預(yù)冷的TBS緩沖液中，1200r/min，4℃離心10min；棄上清，冰浴上加入TBS緩沖液1mL、蛋白酶抑制劑10pL；超聲時(shí)間2min，停1min，5個(gè)循環(huán)，700g，4℃離心10min；吸取上清于EP管內(nèi)，加入0.5%TritonX-100，冰浴30min；按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)樣品的總蛋白濃度。

1.6AChE活性測(cè)定

利用乙酰膽堿酯酶催化硫代底物出現(xiàn)顯色反應(yīng)來(lái)測(cè)定AChE活性。96孔板，每孔加入0.1tnol/LPBS50μL，超聲提取的蛋白樣品10μL、10mmol/LS-AchI30μL，充分混勻，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5min或15min；加入1mol/LHC110μL，震蕩混勻，終止反應(yīng)；10min后加0.03%DTNB200μL，總體積300μL，震蕩混勻；5min后酶標(biāo)儀上405nm波長(zhǎng)處測(cè)0D值；15min后405nm測(cè)OD值，15minOD值減去5min0D值，求得□A；根據(jù)公式AChE（U/mL）=AA/minx0.3/（13.6x0.01x1），再除以相應(yīng)蛋白濃度，求出AChE活性。

1.7ELISA測(cè)AChE蛋白表達(dá)量

應(yīng)用雙抗體夾心法，具體步驟按照ELISA試劑盒（R&D）說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.8總RNA提取

按照Trizol試劑盒（Invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9RT-PCR1.9.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索AChE、GAPDH基因的cDNA序列，用PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)，由上海碩世生物科技有限公司合成（表1）。

1.9.2cDNA合成與PCR反應(yīng)

逆轉(zhuǎn)錄體系20m-L：TotalRNA1|j.g，Oligo（dt）Primer（2.5μmol/L）1μL，RNaseFreewater適量，定量至總體積13μL。65°C，10min，立即置于冰上，靜置2min，加入5xRTBuffer4μL，dNTPMix-ture（各10mmol/L）2μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，ReverTraAce（20U/（μL）0.5μL。55℃孵育30min，85℃加熱5min，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系20μL：qPCRMasterMix（2x）10μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板1μL，DD Water7μL；PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；30x（95℃，30s；57°C，30s；72°C，30s），72℃延伸1min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

1.10 Real-timePCR

1.10.1引物設(shè)計(jì)

引物序列用PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)，由上海碩世生物科技有限公司合成（表2）

1.10.2基因水平的定量檢測(cè)

采用FAM熒光探針?lè)ǎ珿APDH作為內(nèi)參，Real-timePCR反應(yīng)體系20μL：qPCRMasterMix（2x）10μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，熒光探針（10μmol/L）0.5μL，cDNA模板1-2μL，DDWater加至20μL，每一樣品做3個(gè)復(fù)孔；Real-timePCR反應(yīng)條件：40x（95℃，5min；95℃，10s，55°C，40s，72℃，1min）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文中的所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間兩兩比較采用Krnskal-WallisH檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1Tn抗原的表達(dá)狀況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，白血病細(xì)胞系JurkatT表達(dá)Tn抗原（圖1A）；白血病細(xì)胞K562與正常WBC不表達(dá)Tn抗原（圖1B、C）。

2.2AChE在蛋白水平的表達(dá)分析

Tn+細(xì)胞（JurkatT）AChE活性與Tn-細(xì)胞（K562，正常對(duì)照WBC）相比，活性明顯下降；Tn-細(xì)胞之間，即K562與正常WBC的AChE活性相比，K562明顯低于正常WBC（n=5，P<0.01，圖2A）。ELISA試劑盒檢測(cè)AChE表達(dá)水平，結(jié)果顯示Tn+細(xì)胞（JurkatT）與Tn-細(xì)胞（K562，正常對(duì)照WBC）相比，AChE蛋白含量明顯下降；K562與正常WBC相比，K562明顯低于正常WBC（n=5，P<0.01，圖2B）。

2.3AChE在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析

采用RT-PCR、Real-timePCR方法，以GAPDH為內(nèi)參，比較JurkatT、K562和WBC目的基因的相對(duì)mRNA的表達(dá)水平（見(jiàn)圖3A、B），結(jié)果顯示：JurkatT細(xì)胞AChEmRNA水平明顯低于K562和WBC；K562與正常WBC相比，K562AChEmRNA水平低于正常WBC。

3討論

AChE是催化水解乙酰膽堿為膽堿和乙酸，恢復(fù)突觸后膜極化的酶，在傳遞神經(jīng)沖動(dòng)的過(guò)程中起重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)AChE不僅局限于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，在一些非神經(jīng)組織和器官，如上皮組織、血細(xì)胞等中也有存在[9]。更值得注意的是，AChE的表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。包括神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤例如星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤[10]和非神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，如乳腺癌[11]、肝癌[3]、結(jié)腸癌等。Tn抗原是腫瘤相關(guān)抗原，人類70%～80%的癌癥組織，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮膚癌均可檢測(cè)到Tn抗原的表達(dá)，并且Tn抗原的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[12]。

盡管已在多種類型的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了AChE的表達(dá)水平較正常細(xì)胞偏低[13、14]，但是在Tn+的腫瘤細(xì)胞中AChE的表達(dá)水平如何未見(jiàn)報(bào)道我們分別從基因及蛋白水平研究AChE在正常白細(xì)胞及白血病細(xì)胞的表達(dá)狀況。發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞JurkatT及K562中AChE的活性及含量均低于正常白細(xì)胞，而JurkatT細(xì)胞中AChE的活性及含量明顯低于K562細(xì)胞。更值得注意的是JurkatT細(xì)胞表達(dá)Tn抗原，但K562細(xì)胞不表達(dá)Tn抗原。

總之，我們首次提出在人白血病細(xì)胞中AChE的表達(dá)及活性與Tn抗原的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。目前研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中Cosmc基因異常導(dǎo)致T-synthase折疊錯(cuò)誤，糖基化途徑異常致Tn抗原的表達(dá)AChE基因位于人類7號(hào)染色體上（7q22），白血病、卵巢癌和乳腺癌AChE7q22染色體缺失，骨髓增生異常綜合征、急性髓樣白血病AChE基因拷貝數(shù)量改變，肺癌組織中AChE糖基化異常。AChE經(jīng)過(guò)連接糖基化、適當(dāng)折疊盤曲才能形成有活性的AChE，缺乏糖基化修飾的AChE活性下降臣多在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解；AChK3個(gè)糖基化位點(diǎn)上（AChETN296Q、AChh：TN381Q、AChETN495Q）任一位點(diǎn)的突變體及3個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變的突變體（A-ChETN296Q/N381Q/N495Q）轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，AChE活性有不同程度的下降，AChETN381Q、AChE-TN296Q/N381Q/N495Q尤為明顯[16、17]。因此AChE基因轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后修飾的異?？赡苁怯绊慉ChE表達(dá)的主要原因：這與我們發(fā)現(xiàn)的膜糖蛋白糖基化異常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表達(dá)Tn抗原，似乎存在某種關(guān)聯(lián)與Tn-腫瘤細(xì)胞相比，Tn+的腫瘤細(xì)胞中AChE的基因是否有異常，Tn+的腫瘤細(xì)胞中AChE對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡的影響如何還有待進(jìn)一步研究。

4展望

我們研究發(fā)現(xiàn)在白血病細(xì)胞中，AChE的表達(dá)與Tn抗原的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。有研究表明，雖然在結(jié)腸癌細(xì)胞中AChE的表達(dá)量較正常細(xì)胞低，但在不表達(dá)Tn抗原的結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2中AChE過(guò)表達(dá)。提示可能在結(jié)腸癌細(xì)胞中Tn抗原的表達(dá)與AChE的表達(dá)也存在負(fù)性相關(guān)的關(guān)系：有關(guān)Tn抗原及AChE在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)的機(jī)制研究均有相關(guān)報(bào)道。但在Tn+的腫瘤細(xì)胞中，AChE表達(dá)量及活性降低的機(jī)制尚不清楚，可能Tn抗原的表達(dá)影響了AChE的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)蛋白。在其他Tn+的腫瘤細(xì)胞及組織中是否也存在AChE的表達(dá)異常仍待深人研究明確Tn抗原與AChE在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)之間的關(guān)系，有助于全面了解AChE及Tn抗原的生物學(xué)功能，認(rèn)清Tn抗原及AChE異常表達(dá)的病理學(xué)意義，為腫瘤的診斷、治療及預(yù)后提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為以Tn抗原或AChE為靶點(diǎn)治療腫瘤制定新策略。

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