徐宗凱 林青青 周夢(mèng)瑩 劉思靜 黃耀 李文熙 李興橋 余倩 汪川

摘要：通過(guò)對(duì)3種李斯特菌菌體蛋白提取方法主要是破壁方式的比較，找到一種可高效提取李斯特菌菌體蛋白的方法，為該菌的深入研究提供可靠技術(shù)。以綿羊李斯特菌新鮮液體培養(yǎng)物為材料，收集菌沉淀，分別選用3種破壁方式破除細(xì)胞壁，三氯乙酸（trichloroaceticacid，TCA）-丙嗣沉淀法沉淀破壁液中的菌體蛋白，采用聚丙稀酰氨凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）和Western-blot分析所得菌體蛋白。溶菌酶-超聲破壁-TCA-丙酮沉淀法提取得到的李斯特菌菌體蛋白SDS-PAGE條帶清晰豐富，Western-blot條帶特異。溶菌酶-超聲破壁-TCA-丙酮沉淀法可有效提取李斯特菌菌體蛋白，滿(mǎn)足常用蛋白分析技術(shù)的要求，是一種提取李斯特菌菌體蛋白的可靠方法。

關(guān)鍵詞：李斯特菌；蛋白質(zhì)；提取；超聲破壁

中圖分類(lèi)號(hào)：Q71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0029-05

ComparisonofThreeMethodsforExtractionofNon—secretedProteinsfromListeria

XUZong-kai，LINQing-qing，ZHOUMeng-ying，LIUSi-jing，HUANGYao，LIWen-xi，LIXing-qiao，YUQian，WANGChuan

（DepartmentofPublicHealthLaboratorySciences，WestChinaSchoolofPublicHealth，SichuanUniversity，Chengdu610041，Sichuan，China）

Abstract：Threemethodsofextractingnon-secretedproteinsfromListeriawerecompared，mainlydifferentinlysisprocess，toobtainanefficientnon-secretedproteinsextractingmethodforListeria，toprovideareli?abletechniqueforthefurtherstudyofListeria.FreshbrothcultureofListeriaivanoviiwasusedasstudymaterial.Bacteriadepositwascollectedbycentrifugation，andthreelysingapproacheswereadoptedsepa?rately.Non-secretedproteinswereobtainedthroughthemethodoftrichloroaceticacid（TCA）-acetonepre?cipitationinthelysissolution，andverifiedbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis（SDS-PAGE）andWestern-blot.SDS-PAGEbandsofnon-secretedproteinsextractedviathemethodof1ysozyme-ultrasonication-TCA-acetoneprecipitationweredistinctandsufficient，andtheWestern-blotre?sultswerespecific.Themethodoflysozyme—ultrasonication—TCA—acetoneprecipitationcanbeusedtoex?tractListerianon-secretedproteinsefficiently，whichisqualifiedforcommonproteinexperiments，andisareliablemethodforextractingnon-secretedproteinsfromListeria.

Keywords：Listeria；protein；extraction；ultrasonication

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：029-033）

李斯特菌是一類(lèi)革蘭陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌，包括單增李斯特菌U—monocytogenes，LM）、綿羊李斯特菌（Livanovii，LI）等7個(gè)菌種，具有獨(dú)特的胞內(nèi)增殖規(guī)律：進(jìn)入胞內(nèi)，逃逸胞吞泡，在細(xì)胞漿內(nèi)增殖，以細(xì)胞-細(xì)胞的傳播方式擴(kuò)大感染細(xì)胞范圍[1、2]。李斯特菌在吞噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞胞漿內(nèi)增殖的生物學(xué)特點(diǎn)，是該菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的最主要因素，也是其作為T(mén)細(xì)胞免疫應(yīng)答研究工具的生物學(xué)基礎(chǔ)[3、4]。由于李斯特菌能誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，使得該菌被越來(lái)越多地用于減毒活菌載體重組疫苗的構(gòu)建[5-7]：在構(gòu)建以李斯特菌為載體的重組疫苗研究中，重組菌蛋白質(zhì)表達(dá)的驗(yàn)證是關(guān)鍵的一步.同時(shí)研究者還需了解目的蛋白是存在于菌體內(nèi)還是分泌到胞外。目前發(fā)表的文獻(xiàn)中，尚未查到成熟的、重復(fù)性好，且適用于李斯特菌菌體蛋白的提取方法。本研究采用幾種方法分別提取李斯特菌菌體蛋白，然后用SDS-PAGE電泳及Westernblot進(jìn)行檢測(cè)，希望能為該菌的深入研究提供一種獲取菌體蛋白的可靠手段。

1材料與方法

1.1菌株及培養(yǎng)條件

綿羊李斯特菌野生株（LI）和重組株LI-HA（能分泌表達(dá)帶HA抗原標(biāo)簽的結(jié)核桿菌Ag85C蛋白，約43kD），單增李斯特菌重組株LM-0VA（能分泌表達(dá)帶HA抗原標(biāo)簽的卵白蛋白，約35kD），由四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫系實(shí)驗(yàn)室提供。所有菌株均用腦心浸液培養(yǎng)基（brianheartinfusion，BHI）于37℃培養(yǎng)。

1.2主要試劑及儀器

HA-單克隆抗體、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）、考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），三氯乙酸（TCA）（美國(guó)Sigma公司），β-巰基乙醇、0.1%（W/V）溴酚藍(lán)（美國(guó)Amresco公司）、HRP化學(xué)發(fā)光底物顯色反應(yīng)液（美國(guó)ThermoFisher公司），PVDF膜（美國(guó)Millipore公司），超聲破碎儀（美國(guó)S0N-ICS公司），低溫局速離心機(jī)（美國(guó)ThermoFisher公司），TS-A型脫色搖床（江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠），分光光度計(jì)（美國(guó)Unico公司），PAGE垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），DY-CZ-40D型轉(zhuǎn)移電泳槽（北京六一儀器廠），Chemi-DocXRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad公司），DYY-DI2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），恒溫氣浴搖床（美國(guó)ThermoFisher公司）。

1.3主要試劑的配制

1.3.1重懸液

稱(chēng)取1g蔗糖和10mg溶菌酶，溶解于3.7mLddH2O，加入0.5mL0.1mol/LPBSpH7.0，濾過(guò)除菌，分裝，-20℃保存。

1.3.2裂解液1

取300μL1mol/LTris-HClpH8.0溶液，6mL10%SDS溶液，加ddH2O至10mL，濾過(guò)除菌，分裝，-20℃保存。

1.3.3裂解液2

取300μL1mol/LTris-HClpH8.0溶液，60μL0.5mol/LEDTApH8.0溶液，6mL10%（W/V）SDS溶液，10mg/mL蛋白酶K，加ddH2O至10mL，濾過(guò)除菌，分裝，-20℃保存。

1.3.4蛋白溶解液

稱(chēng)取4gSDS粉末，溶解于10mL0.5mol/LTris-HClpH8.0溶液，濾過(guò)除菌，分裝，-20℃保存：

1.3.52xloading buffer

加入2.5mL0.5mol/LTris-HClpH6.8、2mL甘油、4mL10%（W/V）SDS，0.5mL0.1%（W/V）溴酚藍(lán)，用ddH20定容至10mL，分裝，-20℃保存，臨用時(shí)加入β-琉基乙醇至終濃度為5%。

1.3.6TBST

稱(chēng)取3.52gNaCl，加入4mL1mol/LTris-HClpH7.5，純水定容至400mL，然后加入0.2mLTween-20。

1.3.7封閉液

稱(chēng)取1.5g脫脂奶粉，用TBST30mL溶解。

1.4細(xì)菌菌體蛋白樣品提取

1.4.1溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法

將細(xì)菌接種5mLBHI肉湯，37°C200r/min搖育過(guò)夜，取500μL增菌液轉(zhuǎn)移至另一支10mLBHI肉湯中，37°C200r/min搖育，以BHI肉湯為空白調(diào)零，測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液當(dāng)OD600，當(dāng)OD600≈0.8時(shí)，取5mL菌液，13000r/min離心2min，棄上清，加入2mL無(wú)菌PBS，13000r/min離心2min，棄上清，加入300μL重懸液，吹打使菌體重懸，37℃水浴2h，加人300μL裂解液1，37℃水浴30min，加入500μL4℃預(yù)冷的飽和三氯乙酸（500g三氯乙酸用227mL純水溶解），冰浴45min，4℃13000r/min離心30min，棄上清。加入已于-20℃預(yù)冷的丙酮20mL，4℃13000r/min離心10min，棄上清，加入100μL蛋白溶解液溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移至EP管，加入等體積2xloading buffer，沸水浴煮5min，-20℃保存。

1.4.2溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-丙酮沉淀法

細(xì)菌培養(yǎng)和收集步驟同上，加人重懸液37℃水浴2h后，加入300μL裂解液2，37℃水浴30min，加入500μL4℃預(yù)冷的飽和三氯乙酸，后續(xù)步驟同上。

1.4.3溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法

細(xì)菌培養(yǎng)和收集步驟同上，加入重懸液37℃水浴2h后，加入5mL無(wú)菌水，超聲波破碎菌體細(xì)胞（振幅100%，脈沖5s，停歇5s，總共脈沖4min），加入500μL4℃預(yù)冷的飽和三氯乙酸，后續(xù)步驟同上。

1.5細(xì)菌分泌蛋白樣品提取

細(xì)菌接種5mLBHI肉湯，37V200r/min搖育過(guò)夜，將5mL增菌液轉(zhuǎn)移至60mLBHI肉湯中，37℃200r/min搖育，以BHI肉湯為空白調(diào)零，測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液OD600，當(dāng)OD600≈1時(shí)，取40mL菌液于13000r/min離心2min，取上清液35mL置于50mL離心管中，加入3.5mL4℃預(yù)冷的飽和氯乙酸，冰浴30min后，413000r/min離心30min，棄上清，加入已-20℃預(yù)冷的丙酮20mL，4℃13000r/min離心10min，棄上清。加入100蛋白溶解液溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移至EP管，加入等體積2xloadingbuffer，沸水浴煮5min，-20℃保存。

1.6SDS-PAGE檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量10μL平行上樣，濃縮電壓80V，分離電壓120V，電泳1.5h，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色至背景清晰。

1.7Western-blot

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，恒流200mA轉(zhuǎn)PVDF膜1.5h，將膜于30mL封閉液中，20℃搖床上封閉1h，將膜置于30mLTBST中，20℃搖床上洗膜10min，加入用TBST稀釋的HA單抗（1：5000）10mL，4℃孵育過(guò)夜，將膜置入30mLTBST中，20℃搖床上洗膜10min，重復(fù)3次，加入用TBST稀釋的二抗（HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG）（1：1000）10mL20℃孵育1h，將膜置入30mLTBST中，20℃搖床上洗膜10min，重復(fù)3次，將HRP化學(xué)發(fā)光底物顯色反應(yīng)液滴加于膜表面，ChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2結(jié)果

2.1SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

圖1可見(jiàn)，溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法提取李斯特菌菌體蛋白只能在小于19KD處見(jiàn)到一明顯條帶，其余位置僅可見(jiàn)少量極淡條帶，豐度和清晰度皆不夠。圖2可見(jiàn)，溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-內(nèi)酮沉淀法提取的李斯特菌菌體蛋白僅能在約35kD處見(jiàn)到明顯條帶，其余條帶幾乎不可見(jiàn)。圖3可見(jiàn)，溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取的李斯特菌菌體蛋白，電泳條帶豐度較高，條帶清晰。圖4可見(jiàn)，TCA-丙酮沉淀法提取的李斯特菌分泌蛋白，電泳條帶較清晰，豐度較高。

以上結(jié)果表明，溶菌酶-超聲破壁-TCA-丙酮沉淀法提取李斯特菌菌體蛋內(nèi)質(zhì)豐度最高

2.2Western-blot檢測(cè)結(jié)果

圖5可見(jiàn)，溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取的LI-HA菌體蛋白在約43kD處有清晰條帶，LM-OVA菌體蛋白（菌體蛋白陰性對(duì)照）及LI菌體蛋白（菌體蛋白陰性對(duì)照）均無(wú)條帶。圖6可見(jiàn)，TCA-丙酮沉淀法提取的LI-HA分泌蛋白在約43kD處有清晰條帶，LM-0VA分泌蛋白（分泌蛋白陽(yáng)性對(duì)照）在約35kD處有清晰條帶，LI分泌蛋白（陰性對(duì)照）無(wú)條帶。

3討論

以李斯特菌為載體的重組疫苗是當(dāng)前T細(xì)胞免疫疫苗的一個(gè)研究熱點(diǎn)，對(duì)該類(lèi)型疫苗免疫學(xué)價(jià)值的研究需要以重組抗原的良好表達(dá)作為前提，常用的Western-Wot法和SDS-PAGE法都建立在成功從李斯特菌中提取蛋白的基礎(chǔ)之上。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，當(dāng)細(xì)菌處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，即將進(jìn)入穩(wěn)定期（OD600≈0.8）時(shí)，此時(shí)細(xì)菌數(shù)量基本已至最大，且對(duì)外界環(huán)境因素的影響最敏感，最適于提取菌體蛋白，而當(dāng)細(xì)菌完全進(jìn)入穩(wěn)定期后（OD600≈1.0），此時(shí)積累大量分泌蛋白，適于提取。

細(xì)菌分泌蛋白主要存在于培養(yǎng)物的上清液中，可以通過(guò)TCA-丙酮沉淀的方法收集。菌體蛋白的提取需要充分裂解李斯特菌，釋放胞內(nèi)蛋白。由于李斯特菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁厚，常規(guī)方法不易破壁，故作為本研究的重點(diǎn)。

常用裂解細(xì)菌的方法有機(jī)械法、化學(xué)法和酶法[8]。本研究中分別采用了SDS、蛋白酶K和超聲破碎結(jié)合溶菌酶的破膜方式。溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法對(duì)李斯特菌的裂解效果不理想，蛋白釋放不完全，結(jié)果中小于19kD處的條帶疑似為溶菌酶（約14kD）條帶；溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-丙酮沉淀法由于蛋白酶K水解作用具有高

效的酶活性和底物廣譜性，對(duì)細(xì)菌所有蛋白都有降解作用，故只在約35kD處出現(xiàn)一條疑似蛋白酶K（約30kD）的條帶。上述兩種方法均不能滿(mǎn)足分析李斯特菌菌體蛋白的要求，而經(jīng)本研究證實(shí)，溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法能夠有效地裂解李斯特菌，充分釋放細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)蛋白并保證蛋白質(zhì)完整性。

根據(jù)LM-OVA菌體蛋白與分泌蛋白West-ern-hlot結(jié)果分析可知，該種將細(xì)菌培養(yǎng)物先離心后再取沉淀提取菌體蛋白的方法，可有效避免細(xì)菌分泌蛋白的干擾，從而對(duì)細(xì)菌蛋白表達(dá)方式的研究具有一定的意義。

溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低、不引入干擾物質(zhì)等特點(diǎn)，能夠滿(mǎn)足對(duì)李斯特菌蛋白的SDS-PAGE和West-ern-hlot分析的要求。分析3種方法，可認(rèn)為其中超聲破碎起主要作用[9-12]。值得注意的是，溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法中超聲強(qiáng)度尤為重要，可根據(jù)具體的樣品量和儀器進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，超聲強(qiáng)度一般控制在略低于產(chǎn)生泡沫的水平。在超聲破碎的過(guò)程中需要將樣品置于冰上，避免超聲產(chǎn)生的高溫使蛋白質(zhì)變性；并適當(dāng)調(diào)整探頭位置，避免產(chǎn)生泡沫。

本研究中的李斯特菌菌體蛋白提取方法一次可收集蛋白約100μL，足夠進(jìn)行多次SDS-PAGE或Westmi-blot分析。該方法易受TCA濃度的影響，故實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制飽和TCA加入量為反應(yīng)總體積的10%。其次，蛋白質(zhì)充分釋放后應(yīng)保證操作全程低溫，避免蛋白質(zhì)變性或降解。

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