王彥婷 黃智剛 郭西英 汪盛

摘要：真核生物的許多蛋白富含二硫鍵。由于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中含有二硫鍵還原酶，利用大腸桿菌生產(chǎn)具有生物活性的重組二硫鍵蛋白充滿挑戰(zhàn)。近年來(lái)，SHuffle菌株、超氧化性細(xì)胞的相繼問(wèn)世，利用分子伴侶或引入二硫鍵從頭形成體系，使多二硫鍵蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)成為可能。簡(jiǎn)要概述了野生型大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)和經(jīng)遺傳改造的工程茵細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵的形成機(jī)制，并著重介紹了近年來(lái)重組二硫鍵蛋白表達(dá)策略的最新研究進(jìn)展，對(duì)利用大腸桿菌反應(yīng)器生產(chǎn)富含二硫鍵蛋白起指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：二硫鍵蛋白：大腸桿菌；Dsb蛋白；分子伴侶；巰基氧化酶；超氧化性細(xì)胞

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2015）03-0258-07

蛋白質(zhì)在細(xì)胞的各種生命活動(dòng)中扮演了重要的角色，如信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞粘附等。20世紀(jì)70年代，DNA重組技術(shù)的應(yīng)用，使蛋白質(zhì)能在多種宿主細(xì)胞中表達(dá)[1]?？傮w上，高產(chǎn)率重組蛋白的獲得比較困難且不可預(yù)計(jì)，尤其是目標(biāo)蛋白存在翻譯后修飾，如形成二硫鍵。真核生物內(nèi)的二硫鍵蛋白普遍存在，對(duì)人類基因組的預(yù)測(cè)表明，大約30%的蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而其中一半數(shù)量含有二硫鍵[2]。二硫鍵可在構(gòu)象上固定多肽鏈的骨架或改善其熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，以抵抗高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等傷害。因此，二硫鍵蛋白常被分泌到細(xì)胞外或錨定于細(xì)胞膜，它們適于作為治療藥物（如胰島素、抗體）或制藥產(chǎn)業(yè)的靶標(biāo)蛋白[3]。工業(yè)化生產(chǎn)及科學(xué)研究也需要大量的活性蛋白。

真核細(xì)胞（酵母、昆蟲、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）表達(dá)二硫鍵蛋白，時(shí)間長(zhǎng)且花費(fèi)大，而無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系難以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大化生產(chǎn)。大腸桿菌是目前首選宿主菌之一，因其具備生長(zhǎng)快、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高等特點(diǎn)備受人們青睞[3]。大腸桿菌中二硫鍵蛋白的形成定位于細(xì)胞周質(zhì)，但蛋白產(chǎn)率低。而大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)缺乏真核蛋白表達(dá)所需的翻譯后加工機(jī)制，因此多數(shù)二硫鍵蛋白在細(xì)胞質(zhì)中形成包涵體。蛋白包涵體只能通過(guò)變性、復(fù)性等過(guò)程獲取一定比例的活性蛋白，且方法繁瑣、產(chǎn)率低下、通用性不強(qiáng)。因此如何改善大腸桿菌細(xì)胞的表達(dá)環(huán)境以獲得高產(chǎn)率的活性二硫鍵蛋白，是科學(xué)家們致力于解決的難題。本文介紹了大腸桿菌中二硫鍵的形成機(jī)制，并綜述近年來(lái)二硫鍵蛋白表達(dá)策略的最新研究成果，為富含二硫鍵蛋白在大腸桿菌反應(yīng)器的重組表達(dá)或工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)二硫鍵的形成

1.1周質(zhì)蛋白分泌機(jī)制

多數(shù)大腸桿菌分泌蛋白首先被合成蛋白前體。它們的信號(hào)肽由Sec分子識(shí)別，根據(jù)信號(hào)肽的種類，Sec機(jī)制分為翻譯后和共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)兩種方式。在前者，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的伴侶分子SecB與前體蛋白結(jié)合，并維持蛋白的未折疊狀態(tài)直至接觸移位酶。而共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)方式是在翻譯過(guò)程中蛋白的信號(hào)肽由信號(hào)識(shí)別顆粒（signal recognition particle，SRP）識(shí)別，整個(gè)SRP-核糖體一新生多肽復(fù)合物再與Sec移位酶結(jié)合[4] 。少數(shù)分泌蛋白采取一種雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（lwin arginine translocation system，Tac），該系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信號(hào)肽帶有特征性雙精氨酸基序。與Sec機(jī)制不同，Tal系統(tǒng)中蛋白以緊密折疊形式經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜。該系統(tǒng)可能與細(xì)菌產(chǎn)生抗生素耐藥性有關(guān)[4] 。

1.2 DsbA/DsbB氧化系統(tǒng)

轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)的多肽由Dsb蛋白（Ds-bA-DsbG）催化形成二硫鍵。肽鏈半胱氨酸的硫醇鹽陰離子首先親和攻擊DsbA的活性中心，并與DsbA形成分子間二硫鍵中間體。該中間體很不穩(wěn)定，由肽鏈另一個(gè)硫醇鹽陰離子親和攻擊而快速釋放，肽鏈形成二硫鍵，DsbA被還原[5]。

還原態(tài)DsbA經(jīng)DsbB的重新氧化實(shí)現(xiàn)活性再生，而DsbB則通過(guò)電子傳遞系統(tǒng)再被氧化。DsbB是細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，它具有4個(gè)跨膜螺旋的核心區(qū)相兩段暴露于細(xì)胞周質(zhì)的柔性區(qū)。DsbB有兩對(duì)二硫鍵，其柔性區(qū)的二硫鍵首先從DsbA獲得電子，再傳遞給跨膜區(qū)附近的半胱氨酸對(duì)[6] 。該對(duì)二硫鍵被還原后，其中一個(gè)半胱氨酸可與輔因子醌的芳環(huán)形成電荷傳遞復(fù)合體。有氧條件下，電子經(jīng)細(xì)胞色素bo、bd氧化酶?jìng)鬟f給氧氣分子，而缺氧時(shí)，電子的最終受體改變，由甲基萘醌將電子傳給延胡索酸或硝酸鹽等[7] （圖1）。

1.3 DsbC/DsbD異構(gòu)化系統(tǒng)

DsbA參與二硫鍵形成反應(yīng)是快速且非特異的，它傾向于催化順序排布的半胱氨酸對(duì)形成二硫鍵。因此蛋白存在多對(duì)非連續(xù)性二硫鍵時(shí)，就容易發(fā)生錯(cuò)誤配對(duì)，其在細(xì)胞內(nèi)積累或被降解[9]。大腸桿菌存在相應(yīng)的糾錯(cuò)機(jī)制一周質(zhì)中的二硫鍵異構(gòu)酶DsbC，可識(shí)別并幫助錯(cuò)誤折疊蛋白恢復(fù)自然狀態(tài)。

體內(nèi)的DsbC是兩個(gè)亞基組成的同源二聚體，整體呈V形。每個(gè)亞基具有二聚體化和硫氧還蛋白兩個(gè)功能域，它們依靠一段短的螺旋區(qū)連接。DsbC共有4個(gè)半胱氨酸，硫氧還蛋白功能域C端的兩個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵，穩(wěn)定DsbC的空間結(jié)構(gòu)[10]。N端的半胱氨酸對(duì)是DsbC的活性中心，它們具有CXXC催化模序，并由DsbD維持還原狀態(tài)。DsbD是細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，它包含3個(gè)模塊：跨膜功能域DsbDp，細(xì)胞周質(zhì)功能域Dsb Dcv和Dsb-Dy。每個(gè)功能域有一對(duì)活性半胱氨酸。DsbDβ的半胱氨酸對(duì)首先從細(xì)胞質(zhì)硫氧還蛋白獲取電子，再傳遞到DsbDγ功能域，然后經(jīng)DsbDα最終將電子傳遞給DsbC[11]（圖1）。DsbD及其家族蛋白是目前已知的一類將電子從細(xì)胞質(zhì)膜傳遞到細(xì)胞周質(zhì)的氧化還原酶。

事實(shí)上，DsbC并不是DsbD的唯一底物。DsbG為DsbC的同源類似物，它具有CXXC催化模序，由DsbD維持還原態(tài)。最新研究發(fā)現(xiàn)[12]除了異構(gòu)酶活性，細(xì)胞周質(zhì)的DsbG還發(fā)揮還原酶作用。某些周質(zhì)蛋白存在單一半胱氨酸，它們暴露于氧自由基環(huán)境易生成次磺酸，或被進(jìn)一步氧化成磺酸而損害蛋白活性。DsbG表面的負(fù)電荷區(qū)域適于識(shí)別已折疊蛋白，并作為周質(zhì)還原系統(tǒng)的關(guān)鍵因子防止蛋白的單一半胱氨酸遭受氧化損傷。而DsbC內(nèi)部排列的疏水氨基酸，似乎更利于它與未折疊蛋白作用并糾正錯(cuò)配二硫鍵。另外，DsbC也可作為DsbG功能的替補(bǔ)[12] 。

2大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)二硫鍵的形成

2.1 野生型菌株細(xì)胞質(zhì)的還原途徑

大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境不利于蛋白的氧化。Derman等[13] 的開(kāi)創(chuàng)性工作首先闡明了大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中兩條主要的還原途徑。一條是硫氧還蛋白途徑：包括硫氧還蛋白TrxA和TrxC，并由硫氧還蛋白還原酶TrxB維持還原態(tài)；另一條是谷氧還蛋白途徑：其核心是谷胱苷肽還原酶（Glu-tathione reductase），它能還原GshA和GshB兩種酶，這兩類酶與細(xì)胞質(zhì)還原型谷胱甘肽（glu-tathione，GSH）的形成有關(guān)。在細(xì)胞質(zhì)中，GSH可直接參與二硫鍵的還原反應(yīng)，它首先與底物形成中間體復(fù)合物，再由一種谷氧還蛋白（Grxl，Grx2，Grx3）使中間體釋放，生成還原態(tài)底物和氧化態(tài)谷氧還蛋白，后者又在GSH作用下重新恢復(fù)還原態(tài)[14] 。兩條電子傳遞網(wǎng)絡(luò)的還原電勢(shì)均來(lái)自細(xì)胞質(zhì)NADPH池[目（圖2）。

2.2突變菌株細(xì)胞質(zhì)的氧化途徑

在研究野生型菌株細(xì)胞質(zhì)還原途徑時(shí)，Der-man等[13]發(fā)現(xiàn)，同時(shí)缺失兩個(gè)核心基因trxB和gor的菌株無(wú)法存活，但這種致死性可祓細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過(guò)氧化物酶AhpC突變抑制。AhpC*突變體具有二硫鍵還原酶活性，它能在細(xì)胞質(zhì)中富集還原態(tài)Grxl，保證菌株活力[15] 。trxB的缺失使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)氧化型硫氧還蛋白TrxA、TrxB積累，它們可催化形成二硫鍵。此突變株被稱為FA113 （trxB，gor， ah-p C'）[8]，商業(yè)名稱是Origami。利用Origami使膠原4-脯氨酰羥化酶在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)量遠(yuǎn)高于野生型BL21的細(xì)胞周質(zhì)[16] 。此外，該氧化型細(xì)胞質(zhì)也用于富集功能性脂肪酶B、神經(jīng)生長(zhǎng)素的Ig2功能域及幾丁質(zhì)酶等[17]。

（trxB，gor-）菌株雖然可實(shí)現(xiàn)蛋白的氧化折疊，但其細(xì)胞質(zhì)缺乏二硫鍵異構(gòu)化途徑。Bessette等I1SI研究發(fā)現(xiàn)，DsbC在細(xì)胞質(zhì)過(guò)量表達(dá)可有效提高二硫鍵蛋白的活性產(chǎn)率。在體外的無(wú)細(xì)胞體系，它也有同樣效果[19]。受此啟發(fā)，2012年，Lobstein等[3] 基于（trxB-，gor-）菌株，將dsbC基因插入嚴(yán)格控制的細(xì)菌rRNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子rrnB下游，使DsbC在細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)定且過(guò)量表達(dá)，改造菌株命名為SHuffle，（圖3）。他們比較了3種多二硫鍵蛋白：熒光素酶（Gaussia， luciferase，Gluc）、尿激酶、組織纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，vtPA）在SHuffle中的表達(dá)活性，認(rèn)為該菌株促進(jìn)蛋白折疊具有底物特異性。但SHuffle仍成為表達(dá)二硫鍵蛋白的新選擇，如Tait等[20]利用SHuffle表達(dá)人皰疹病毒膜蛋白U24，其產(chǎn)量可比普通的BL21（DE3）細(xì)胞提高4.3倍。

2.3 DsbC在蛋白二硫鍵折疊中的研究

在細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)中表達(dá)二硫鍵蛋白是否需要DsbC的輔助，這與二硫鍵的形成機(jī)制有關(guān)。在細(xì)胞周質(zhì)，DsbA首先向未折疊多肽引入二硫鍵，它傾向于催化順序排布的半胱氨酸對(duì)的氧化。比較而言，（trxB-，gor-）突變體細(xì)胞質(zhì)的二硫鍵形成機(jī)制尚不明確。但與周質(zhì)中未折疊多肽不同，Kramer等[21]報(bào)道核糖體可促進(jìn)新生肽鏈形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，合成蛋白在核糖體通道出口處或已存在部分折疊。這利于氧化酶催化肽鏈形成正確的二硫鍵，因而降低了細(xì)胞質(zhì)蛋白折疊對(duì)DsbC的依賴。這似乎可解釋尿激酶在細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)時(shí)的活性完全依賴DsbC，而在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)對(duì)DsbC的依賴性僅為50%[8]。

DsbC在某些情況下對(duì)細(xì)胞質(zhì)蛋白表達(dá)非常有利。例如，G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled re-ceptors，GPCRs）是最著名的藥物靶標(biāo)分子家族，一直以來(lái)備受科學(xué)家關(guān)注。B類GPCR的細(xì)胞外功能域（extracellular domain，ECD）包含3對(duì)保守的二硫鍵，為蛋白的獲取及結(jié)構(gòu)解析帶來(lái)了較大困難。2008年，Pioszak等[22]將人類甲狀旁腺素受體的ECD構(gòu)建到MBP融合體系，并與DsbC在Origami細(xì)胞質(zhì)內(nèi)共表達(dá)。然后利用目標(biāo)蛋白與DsbC在體外谷胱甘肽緩沖液中孵育，進(jìn)行蛋白二硫鍵重排反應(yīng)。他們最終獲得正確折疊的樣品，解析出該蛋白結(jié)構(gòu)。隨后，利用此體系他們先后成功表達(dá)了皮質(zhì)激素釋放因子受體[23]和垂體腺苷酸環(huán)化酶受體[24]。

3 多二硫鍵蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)策略

隨著大腸桿菌細(xì)胞中二硫鍵形成機(jī)制的深入揭示，很多理論廣泛應(yīng)用于真核生物二硫鍵蛋白表達(dá)。特別是近年來(lái)人們不斷探尋新的方法和體系，使大腸桿菌表達(dá)多二硫鍵蛋白的研究取得了較多成果。

3.1分子伴侶輔助二硫鍵蛋白折疊

一般地，肽鏈經(jīng)過(guò)疏水塌縮、空間盤曲、側(cè)鏈聚集等折疊過(guò)程形成其天然構(gòu)象。二硫鍵的形成和肽基脯氨酰鍵異構(gòu)化是其中的限速步驟。經(jīng)典的“自組裝學(xué)說(shuō)”認(rèn)為，肽鏈氨基酸序列包含了蛋白折疊所需的全部信息。隨著研究深入，Emsc251的“輔助性組裝學(xué)說(shuō)”提出體內(nèi)肽鏈的折疊需要分子伴侶的輔助。分子伴侶可為二硫鍵形成等限速步驟提供較長(zhǎng)的折疊時(shí)間，促進(jìn)蛋白組裝成自然狀態(tài)。

3.1.1 周質(zhì)分子伴侶輔助二硫鍵蛋白表達(dá)

細(xì)胞周質(zhì)的分子伴侶包括FkpA、Skp、DegP、SurA等。FkpA是一類通用的折疊增強(qiáng)子，兼具分子伴侶與肽基脯酰胺順?lè)串悩?gòu)酶（peptidyl-propyl cis-trans isomerase，PPIase）活性。它是V型的同源二聚體，每個(gè)亞基的N端參與二聚體化或具有分子伴侶活性，C端為PPIase功能域。FkpA以二聚體界面形成的疏水口袋結(jié)合底物，并促進(jìn)柔性C端接近底物脯氨酰鍵[25]。它的PPIase活性催化某些穩(wěn)定的反式肽基脯氨酰鍵，異構(gòu)成功能蛋白所必需的順式構(gòu)型。目前已發(fā)現(xiàn)的PPIase分屬于3個(gè)蛋白家族：親環(huán)素、FK506結(jié)合蛋白以及細(xì)小菌素蛋白[4]。

SurA與細(xì)小菌素蛋白類型的PPIase具有同源性，它最早從細(xì)菌抵抗饑餓脅迫中被鑒定。SurA的空間構(gòu)象賦予其分子伴侶活性。它的外形類似非規(guī)則的啞鈴狀，其核心模塊有一個(gè)較深的口袋，偏愛(ài)識(shí)別含Ar-X-Ar基序的底物。Ar指芳香族氨基酸，X指任意氨基酸[26]。其余分子伴侶，如Skp通常捕獲由Sec分泌機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)的未折疊多肽。DegP是HtrA絲氨酸蛋白酶家族的第一位成員，它用于清除細(xì)胞周質(zhì)變性或聚集蛋白，其分子伴侶或蛋白酶活性受溫度調(diào)控[26] 。

因細(xì)胞周質(zhì)獨(dú)特的氧化環(huán)境，可將某些二硫鍵蛋白分泌于周質(zhì)中表達(dá)。但是分泌效率的不可控性以及周質(zhì)Dsb蛋白、分子伴侶含量偏低，帶來(lái)了活性蛋白產(chǎn)量不高等問(wèn)題。在過(guò)表達(dá)的分子伴侶協(xié)助下，蛋白折疊效率增加，活性產(chǎn)率可能提高。2011年，Schlapschy等[27]將FkpA、SurA以及DsbA、DsbC共同構(gòu)建成新型輔助質(zhì)粒pTUM4，使4種折疊酶在細(xì)胞周質(zhì)中過(guò)表達(dá)，提高了分泌蛋白的折疊效率。另外，篩選提升目標(biāo)蛋白分泌效率的菌株類型也是必要的，如JM83、HM125、KS272等。Schlapschy已利用pTUM4輔助了多種二硫鍵蛋白的表達(dá)，包括惡性瘧原蟲表面蛋白48/45，樹(shù)突細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-結(jié)合的非整合素以及各種抗原結(jié)合片段等[27]。

3 .1.2 細(xì)胞質(zhì)分子伴侶增加二硫鍵蛋白可溶性

相比細(xì)胞周質(zhì)，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中存在更多的分子伴侶，與折疊相關(guān)的分子伴侶系統(tǒng)包括三類[2q：觸發(fā)因子（trigger factor，TF）、DnaK-Dnaj-GrpE和GroEL-GroES，細(xì)胞質(zhì)中，短的新生多肽首先與核糖體結(jié)合的TF相互作用，隨著肽鏈延伸，長(zhǎng)鏈多肽由DnaK捕獲。DnaK的N端功能域水解ATP供能，協(xié)助C端完成多肽的折疊。共伴侶素DnaJ可上調(diào)DnaK的ATP酶活性，而增強(qiáng)DnaK與底物的結(jié)合力。另一共伴侶素GrpE通過(guò)催化ATP/ADP交換反應(yīng)介導(dǎo)底物釋放。除非底物已完成折疊，否則它可能將被傳遞給下游的GroEL-GroES系統(tǒng)。GroEL與共伴侶素GroES形成“折疊籠”結(jié)構(gòu)[28]，為底物進(jìn)一步折疊提供良好的環(huán)境。

在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)，多數(shù)重組蛋白受控于強(qiáng)啟動(dòng)子，它們的表達(dá)水平通常較高。但宿主細(xì)胞自身的分子伴侶含量或許無(wú)法滿足新生肽鏈正確折疊的需求，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白可溶性降低，甚至形成包涵體。共表達(dá)分子伴侶可能有效輔助二硫鍵蛋白折疊，增加蛋白可溶性。例如，Kyratsous等[29]設(shè)計(jì)DnaK與GroEL的融合載體，在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中獲得了鼠類朊蛋白的可溶產(chǎn)物。另外，共表達(dá)DnaKJ可防止鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CorA形成包涵體[30]，或提高人類粒系集落刺激因子（human granulo-cyte colony stimulating factor，hG-CSF）在細(xì)胞周質(zhì)的表達(dá)量[31] 。

3.2 融合標(biāo)簽輔助二硫鍵蛋白表達(dá)

除了分子伴侶，利用Dsb蛋白與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，也可促進(jìn)二硫鍵正確形成。目前，已有包含Dsb蛋白的商業(yè)化載體供選擇，如pET-39（Ds-bA）、pET-40（DsbC）。另外，一些細(xì)胞質(zhì)融合標(biāo)簽，如MBP（maltose -binding protein）、NusA（N-Utiliza-tion substance）、TRX（thioredoxin）等也被廣泛使用。MBP由大腸桿菌K12的malE基因編碼，它能增加融合蛋白的溶解性。而且MBP不含半胱氨酸，避免了與目標(biāo)蛋白半胱氨酸形成錯(cuò)配二硫鍵的問(wèn)題。MBP已成功應(yīng)用于真核細(xì)胞蛋白以及人工合成的單鏈抗體（single-chain antibody fragment，scFv）的可溶表達(dá)[32] 。Houry等[33] 揭示NusA是分子伴侶GroEL在體內(nèi)的必須底物。所以NusA可能招募分子伴侶幫助蛋白折疊。另一種TRX標(biāo)簽可防止細(xì)胞質(zhì)蛋白聚集沉淀，甚至挽救錯(cuò)折疊的多二硫鍵肽鏈，如槲寄生毒素、豬胃蛋白酶原A舊等。TRX維持蛋白穩(wěn)定性的機(jī)制尚不清楚，但它可能依賴伴侶活性輔助scFv的折疊，理由是突變其催化中心的半胱氨酸，它仍能促進(jìn)活性scFv的表達(dá)[17] 。

3.3二硫鍵從頭形成體系促進(jìn)蛋白表達(dá)

自然界中二硫鍵的形成可以在三類細(xì)胞內(nèi)隔室中完成，真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體內(nèi)膜空間以及原核細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)。相對(duì)于這些細(xì)胞隔室，大多數(shù)野生型原核細(xì)胞質(zhì)幾乎觀察不到二硫鍵蛋白的存在。Derman等舊通過(guò)（trxB， gor， ahpC）的突變，首先實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生產(chǎn)二硫鍵蛋白。

在（trxB，gor-）工程菌中，細(xì)胞質(zhì)硫氧還蛋白參與硫醇一二硫鍵的交換反應(yīng)，即它依靠還原底物（如核苷酸還原酶）而將二硫鍵轉(zhuǎn)移到其他蛋白（如堿性磷酸酶）中，硫氧還蛋白本身不能催化二硫鍵從頭形成。所以O(shè)rigami等生產(chǎn)的蛋白實(shí)為某些代謝途徑的副產(chǎn)物，蛋白產(chǎn)率普遍偏低[34]。

3.3.1 Ervlp體系在二硫鍵蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

細(xì)胞內(nèi)隔室的情況相反，它們存在二硫鍵從頭形成的催化酶，如巰基氧化酶，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Erol、釀酒酵母線粒體內(nèi)膜空間的Ervlp等。如果向大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)引入二硫鍵從頭形成體系，可能會(huì)大幅提高活性蛋白的產(chǎn)率。但是，此類巰基氧化酶不是直接作用于底物，它們需要媒介蛋白的輔助，如Erol依賴PDI，Ervlp依賴Mia40等[34]。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adeninedinucleotide，F(xiàn)AD）存在時(shí)，釀酒酵母的Ervlp可能獨(dú)立于Mia40，直接利用氧氣分子催化巰基形成二硫鍵[35] 。另外，人們發(fā)現(xiàn)沒(méi)有任何輔因子時(shí)，Ervlp能有效地使變性牛胰胰蛋白酶抑制劑（含兩對(duì)二硫鍵）重新恢復(fù)自然狀態(tài)[34] 。因此Ervlp可能是一種單獨(dú)的催化二硫鍵從頭形成的氧化酶。

利用這一特性，2010年Hat.ahet等[34] 將釀酒酵母的Ervlp引入野生型大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)，首次獲得比（trxB-， gor-）菌株產(chǎn)率更高的活性目標(biāo)蛋白。他們的結(jié)果不僅顛覆了長(zhǎng)久以來(lái)野生型原核細(xì)胞質(zhì)不能產(chǎn)生二硫鍵的普遍觀點(diǎn)，還使人們認(rèn)識(shí)到蛋白的氧化折疊除與反應(yīng)環(huán)境相關(guān)，還與催化酶類有關(guān)。隨后，Nguyen等[3q報(bào)道，利用預(yù)表達(dá)體系可進(jìn)一步提高Ervlp對(duì)蛋白氧化的促進(jìn)效應(yīng)。但同時(shí)還需要融合標(biāo)簽防止折疊中間體聚集。他們通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)預(yù)先表達(dá)Ervlp與二硫鍵異構(gòu)酶，使活性vtPA（含有9對(duì)二硫鍵）的產(chǎn)量比過(guò)去僅依靠DsbC共表達(dá)時(shí)提高800倍以上。另外，該體系也可應(yīng)用于分子間二硫鍵蛋白，如人類抵抗素（Resiscin）是一種抑制脂肪細(xì)胞攝取糖分的激素，成熟的Resistin含有5對(duì)二硫鍵，并依靠1對(duì)分子間二硫鍵形成同源二聚體。以往的表達(dá)體系難以獲得可溶的或均質(zhì)蛋白，利用上述方法顯著提高Resistin同型二聚體的產(chǎn)率。由此可見(jiàn)，這類巰基氧化酶似乎可以促進(jìn)多二硫鍵蛋白的高效表達(dá)。

3.3.2 QSOX體系在二硫鍵蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

另一類靜息巰基氧化酶（quiescin-sulfhydryloxidase，QSOX）是目前已知的唯一具有多功能域的氧化酶。QSOX包括兩個(gè)類似硫氧還蛋白的功能域、富含螺旋的間隔區(qū)以及FAD結(jié)合功能域。與其他單功能域巰基氧化酶Erol，Ervl等類似，QSOX可催化二硫鍵的從頭形成，且具有更強(qiáng)的氧化能力[37] 。利用這一特點(diǎn)，20 12年Abskharon等[38] 報(bào)道了一種新的大腸桿菌表達(dá)體系，他依靠人源重組靜息巰基氧化酶（HsQSOX），在細(xì)胞質(zhì)中成功獲得具有生物活性的朊蛋白。

隨后研究人員針對(duì)QSOX催化二硫鍵形成展開(kāi)了深入研究。2014年Zhang等[39]將QSOX與PDI在Origami B細(xì)胞質(zhì)中融合表達(dá)，構(gòu)建了一種超氧化性細(xì)胞（superoxidizing cells）。他們以一類新近報(bào)道的對(duì)氧化還原敏感的綠色熒光蛋白（redox-sensitive green fluorescent protein， roGFP）監(jiān)鋇0細(xì)胞內(nèi)疏基一二硫鍵氧化還原電位，發(fā)現(xiàn)新型超氧化細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)氧化還原電位為-196 mV，比哺乳動(dòng)物或酵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（約為-230 mV）還高。因此，這種超氧化性細(xì)胞非常利于二硫鍵的形成，明顯提高富含二硫鍵蛋白Gluc、vtPA等的氧化折疊效率，為利用大腸桿菌異源表達(dá)真核生物多二硫鍵蛋白提供了新策略。

4展望

蛋白的氧化折疊除了具有熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)之外，還涉及復(fù)雜的分子體系，所以它是一個(gè)難以解決的科學(xué)問(wèn)題。如果蛋白還存在二硫鍵、糖基化等修飾，其表達(dá)折疊將更加復(fù)雜和難以控制。雖然近年來(lái)，人們利用（trxB-，gor-）工程菌株、超氧化性細(xì)胞或者二硫鍵從頭形成體系，已成功地在大腸桿菌中表達(dá)多種二硫鍵蛋白。但是這些方法存在局限性，它們或許只適用于小范圍的蛋白。隨著生產(chǎn)、研究的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越需要更多新型、通用的二硫鍵蛋白表達(dá)菌株或體系，這將是一個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。但值得一提的是，2014年Georgescauld等[28] 發(fā)表的研究成果解析了分子伴侶輔助蛋白折疊組裝的作用機(jī)制，這為科學(xué)家們理解蛋白折疊的分子機(jī)制帶來(lái)了巨大幫助。同時(shí)，這些理論成果也有助于優(yōu)化已有的方法策略，或?yàn)檠邪l(fā)高效的二硫鍵蛋白表達(dá)體系創(chuàng)造新的契機(jī)。