張曉東 李彩霞 趙靜 楊嬌 王元忠

摘 要：甲羥戊酸激酶是甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵酶。根據(jù)滇龍膽轉(zhuǎn)錄組甲羥戊酸激酶基因GrMK序列，設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性引物克隆該基因，并進(jìn)行序列分析；構(gòu)建原核表達(dá)栽體pGEX-4T-l-GrMK，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta（DE3），重組蛋白在37 0C、1.0 mmoVL IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GrMK蛋白為甲羥戊酸激酶家族成員，具有MK蛋白保守結(jié)構(gòu)域：乳糖激酶/高絲氨酸激酶/甲羥戊酸激酶/磷酸甲羥戊酸激酶（GHMPkinase）N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域和ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域；GrMK與長(zhǎng)春花CrMK親緣關(guān)系最近，原核表達(dá)結(jié)果表明，融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量與推斷大小一致。組織特異性表達(dá)分析結(jié)果表明Gr MK基因主要在根中表達(dá).這些結(jié)果為GrMK蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：滇龍膽：甲羥戊酸激酶；基因克?。槐磉_(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2015）03-0196-07

滇龍膽Gentiana rigescens Frach. Ex Hemsl.是傳統(tǒng)中藥龍膽品種之一，是滇產(chǎn)重要道地藥材。滇龍膽也是常用大宗藥材，是龍膽瀉肝片、小兒清熱片和苦膽草片等200多種中成藥的主要成分[1]。近年來，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)龍膽的需求量在3 000—4 000噸左右，并且醫(yī)療用龍膽需求量每年遞增10%左右，市場(chǎng)缺口很大，導(dǎo)致野生滇龍膽資源遭到毀滅性的破壞[1]。滇龍膽的主要藥效成分為龍膽苦苷，要從根本上解決滇龍膽的藥源問題，必須弄清龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制[2]，為龍膽苦苷的異源生物合成奠定基礎(chǔ)。

龍膽苦苷屬于裂環(huán)烯醚單萜，在植物中單萜一般是通過胞質(zhì)甲羥戊酸（MVA）途徑和質(zhì)體2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成的[3]在長(zhǎng)春花MVA途徑中，甲羥戊酸激酶（mevalonatekinase，MK，EC 2.7.1.36）能夠催化ATP中γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到甲羥戊酸C5羥基上，導(dǎo)致甲羥戊酸5-磷酸和ADP的生成[4]，該酶活性取決于二價(jià)陽離子Mg2+或Mn2+，其適宜pH為7～10，最適pH為8.9[5]。該酶被認(rèn)為是萜類生物合成的調(diào)控酶[6]。在植物中，甲羥戊酸激酶受下游代謝物反饋抑制，法尼基焦磷酸（ FPP）、異戊烯基焦磷酸（IPP）、DMAPP（二甲烯丙基焦磷酸）和櫳牛兒基焦磷酸（ GPP），甚至植基二磷酸（PDP），均能抑制MK蛋白活性I 7|。目前，甲羥戊酸激酶基因MK已從擬南芥[6]、長(zhǎng)春花[8]、丹參[9]、秦艽[10]、三七[11]、杜仲[12]、林煙草[13]等許多植物中分離。Zhuang等將甲烷八疊球菌基因Mm，MyK在大腸桿菌中表達(dá)，純化后結(jié)晶，并使用X射線衍射技術(shù)對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析[14]。MK基因的表達(dá)具有組織特異性，并被生物和非生物因素誘導(dǎo)。在擬南芥中，AtMK基因主要在根和花中表達(dá)；啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AtMK基因上游-295至-194區(qū)域?qū)τ谠摶虻母弑磉_(dá)至關(guān)重要[6]。在杜仲中，EuMK3基因啟動(dòng)子中存在大量的光誘導(dǎo)元件和植物激素誘導(dǎo)元件，因此其轉(zhuǎn)錄活性可能受光和植物激素的調(diào)控[12]。在生物誘導(dǎo)劑（100 mg/mL酵母提取物）和非生物誘導(dǎo)劑（ 30 mmol/L Ag+）共同誘導(dǎo)下，丹參SmMK基因在誘導(dǎo)后12 h表達(dá)量達(dá)到最高[15]。在乳酸鏈球菌中，共表達(dá)MVK和HMGR基因能夠使倍半菲蘭烯（倍半水芹烯）產(chǎn)量加倍[16]。

目前，為選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高抗的龍膽草，云南省已啟動(dòng)長(zhǎng)達(dá)7年的龍膽草航天育種工程[17]。但是，由于龍膽基因組資源極度匱乏[18]導(dǎo)致其分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢。前期作者實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)滇龍膽的根和葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Gr MK基因序列，通過RT-PCR技術(shù)成功地從滇龍膽幼葉中擴(kuò)增到GrMK基因，并進(jìn)行序列分析、原核表達(dá)和組織表達(dá)特異性分析，以期為滇龍膽主要藥效成分的生物合成及其調(diào)控機(jī)理的解析提供幫助。

1 材料與方法

1.1植物材料

滇龍膽采自玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的組培苗和盆栽苗，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽Centiana rigescens Frach.Ex Hemsl.?；蚩寺∷貌牧蠟榈猃埬憻o菌苗幼葉，基因表達(dá)分析使用材料為盆栽3年生滇龍膽的根、莖和葉，采樣日期為2014年5月17日。

1.2方法

1.2.1 葉片總RNA提取及GrMK基因克隆

按照植物多糖組織提取試劑盒（Takara，大連）說明書提取滇龍膽幼葉總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，大連）說明書合成cDNA。根據(jù)原核表達(dá)載體pGEX-4T-l多克隆酶切位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄組中滇龍膽GrMK基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物GrMKBamH I-F和GrMKXho I-R（表1）。采用Tran，sTaq DNA Polymerase High Fidelity（2.5 U/μL，Transgene，北京）酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94 °C變性30 s，55℃退火30 s，72 °C延伸1 min 10 s，30循環(huán)；72 °C延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.O%瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠后使用膠回收試劑盒（Qiagen，德國(guó)）對(duì)目的片段進(jìn)行回收，將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（Takara，大連），涂布于含100 mg/L氨芐青霉素（Takara，大連）+IPTG（Takara，大連）+X-Gal（Takara，大連）的LB固體平板上，37 0C培養(yǎng)13 h后挑取12個(gè)白斑，37 0C、250 r/min搖床培養(yǎng)12 h后提取12管質(zhì)粒，從大小正確的質(zhì)粒中選取3個(gè)，經(jīng)單雙酶切鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序，獲得重組質(zhì)粒pMD19-Gr MK。1.2.2 GrMK基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及原核表達(dá)

分別對(duì)質(zhì)粒pGEX-4T-l（實(shí)驗(yàn)室保存）和pMD19-GrMK進(jìn)行雙酶切、連接，獲得原核表達(dá)載體pGEX-4T-l-GrMK。使用熱激法將重組質(zhì)粒pGEX-4T—l—GrMK轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（ DE3）感受態(tài)細(xì)胞（Transgene，北京）后，挑取單菌落接種于3 m_L含100 mg/L氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37 0C、250 r/min培養(yǎng)12 h。然后以1：100比例轉(zhuǎn)接到無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 0C、250 r/min培養(yǎng)3h至A600≈0.8，在37 °C、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)以相同條件的pGEX-4T-l轉(zhuǎn)化菌作為對(duì)照。分別誘導(dǎo)Oh、2h、4h和6h后收集菌液2 mL。4 °C、8 000 r/min離心1 min，棄上清，加入100 yLddH20、25 yL的5xSDS-PAGE上樣緩沖液，震蕩懸菌，沸水煮5 min。4 °C、13 000 r/min離心5min。取20μL上清上樣，進(jìn)行SDS-PAGE（5 %濃縮膠和10%分離膠）電泳檢測(cè)。

1.2.3 Gr MK基因的生物信息學(xué)分析

使用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，應(yīng)用Genetyx進(jìn)行翻譯，使用DNAMAN 7進(jìn)行多序列比對(duì)；用Clustal X2.1進(jìn)行比對(duì)，然后使用MEGA6.0軟件內(nèi)置的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap=1 000；利用在線數(shù)據(jù)庫（http：//molbiol. edu.ru/eng/scripts/Ol_ll.html）進(jìn)行稀有密碼子分析。使用ChloroP服務(wù)器vl.l進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)；使用Interpro軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；使用ProtScalee軟件進(jìn)行疏水性分析；使用PredictProtein對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用Swiss-Model Workspace自動(dòng)模式對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用Expasy中的TMHMM工具預(yù)測(cè)蛋白的跨膜螺旋區(qū)；利用在線工具WOLF PSORT預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.2.4 GrMK基因的實(shí)時(shí)定量分析

分別取3年生滇龍膽的根、莖和葉，提取總RNA，使用DNase I處理除去基因組DNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，大連）合成第一鏈cDNA。以轉(zhuǎn)錄組中Gr GA PDH基因（GenBank登錄號(hào)KM061807）作為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物GrGAPDH—F和GrGAPDH-R（表1），PCR反應(yīng)條件為：95 0C 3 min，95 0C 15 s，60 0C 31 s。根據(jù)GrMK基因的ORF序列設(shè)計(jì)特異性引物GrMK-F和GrMK-R（表1）。使用SuperReal PreMix Plus試劑盒（天根，北京）進(jìn)行qPCR，PCR反應(yīng)條件為：95 0C 3 min，95 0C15 s，60 0C 31 s。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)在ABI7000熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，USA）上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線由定量PCR儀軟件自動(dòng)生成。使用內(nèi)參基因Gr GA PDH表達(dá)校準(zhǔn)后，計(jì)算根莖葉中GrMK基因相對(duì)表達(dá)量。采用比較Ct值的“2-Ana'的方法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)的分析處理。

2結(jié)果與分析

2.1滇龍膽GrMK基因的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板，使用特異性引物GrMKBamH I-F和GrMKXho I-R擴(kuò)增出約1 200 bp的片段。通過TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrMK。

2.2 GrMK基因的生物信息學(xué)分析

利用Genetyx和DNAMAN軟件對(duì)GrMK基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示GrMK基因ORF為1 138 bp，編碼387個(gè)氨基酸。將該序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)KJ917167。

使用GenBank數(shù)據(jù)庫BLASTp程序?qū)rMK蛋白進(jìn)行相似性分析，結(jié)果表明滇龍膽GrMK與長(zhǎng)春花CrMK蛋白序列相似性最高（85.79%），與擬南芥AtMK （67.29%）蛋白相似性較低。利用DNAMAN 7將GrMK蛋白氨基酸序列與NCBI中相似性較高的部分序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果表明GrMK蛋白與已知蛋白序列保守性較高（圖1）。利用Mega 6.0將GrMK蛋白與NCBI中相似性較高的部分序列和文獻(xiàn)已報(bào)道的部分序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示滇龍膽GrMK蛋白與長(zhǎng)春花CrMK處于同一進(jìn)化枝（圖2），表明二者親緣關(guān)系較近。

使用ProtParam tool對(duì)GrMK蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明GrMK蛋白單體相對(duì)分子質(zhì)量41.12 kD，這與長(zhǎng)春花CrMK單體40.50 kD和擬南芥AtMK單體40.70 kD大小相類似[5]；pI為5.34；帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為30，帶負(fù)電氨基酸殘基（Asp+Glu） 為30， 化學(xué)方程式為：C1817H2936N476O562S21。不穩(wěn)定指數(shù)為31.22，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為100.57，總平均疏水性（ GRAVY）為0.21，為疏水蛋白。GrMK蛋白含有20種基本氨基酸，其中亮氨酸和絲氨酸含量最高，均為10.60c/0；其次是丙氨酸和甘氨酸，分別為9.00%和8.800/0；色氨酸含量最低，為1.00%。

利用SSpro方法對(duì)GrMK蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中d一螺旋（H）占40.830/0，無規(guī)則卷曲（C）占40.31010，延伸帶（E）占18.860/0。利用Swiss-Model Workspace使用自動(dòng)模式預(yù)測(cè)GrMK蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3，該模型以甲烷八疊球古菌甲羥戊酸激酶[4hacA]為模板，在第2-382氨基酸處建模，序列相似度為22.51%。使用InterPro在線工具對(duì)GrMK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明GrMK蛋白包含5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，它們分別為：甲羥戊酸激酶伴乳糖激酶結(jié)構(gòu)域（7-31，136-158，193-212，330-347）、甲羥戊酸激酶結(jié)構(gòu)域（6-384）、乳糖激酶/高絲氨酸激酶/甲羥戊酸激酶/磷酸甲羥戊酸激酶（ GHMP kinase）N端結(jié)構(gòu)域（133-212）、GHMP激酶ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（13 8一149）和GHMP激酶C端結(jié)構(gòu)域（294-350）。

利用SignalP 4.1服務(wù)器分析GrMK蛋白，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白。利用TMHMM工具預(yù)測(cè)GrMK蛋白的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果表明GrMK蛋白不含有跨膜區(qū)域（圖4），為非膜蛋白。使用CldoroP在線軟件對(duì)葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明GrMK蛋白不含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。使用WoLF PSORT軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果為GrMK蛋白在細(xì)胞核、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)的定位系數(shù)分別為8.0、4.0和2.0，這與文獻(xiàn)報(bào)道的MVA途徑存在于細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)論相矛盾[3]。

對(duì)GrMK基因進(jìn)行稀有密碼子分析，結(jié)果表明GrMK基因中稀有密碼子僅占0.78010，且無二聯(lián)或三聯(lián)稀有密碼子連續(xù)出現(xiàn)的情況，因此可選用表達(dá)菌BL21或Rosetta （DE3）進(jìn)行原核表達(dá)。

2.3 GrMK基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用BamH I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrMK，可切出目的片段和載體（圖5），表明Gr MK基因已成功插入載體pGEX-4T-l。

2.4 GrMK基因的原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-l-GrMK轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（ DE3）后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在37 0C、終濃度為1 mmol/L IPTG下，分別誘導(dǎo)表達(dá)Oh、2h、4h和6h后，提取細(xì)菌總蛋白進(jìn)行SDS -PAGE分析。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，pGEX-4T-l-GrMK轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子質(zhì)量67.12 kD（含GST標(biāo)簽蛋白26.00 kD）左右有1條蛋白條帶，并且隨誘導(dǎo)時(shí)間增加其蛋白含量逐漸增加，表明重組質(zhì)粒pGEX -4T-1-GrMK在大腸桿菌Rosetta（ DE3）中成功誘導(dǎo)表達(dá)了GrMK蛋白。當(dāng)溫度為37 0C、誘導(dǎo)時(shí)間為6h時(shí)，蛋白表達(dá)量最大（圖6），可直接用于下一步的蛋白純化。

2.5 GrMK基因的組織表達(dá)分析

取3年生滇龍膽的根、莖和葉，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析GrMK基因在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，GrMK基因在根中表達(dá)量最高，約是莖和葉的2倍和485倍；其次是莖，表達(dá)量最低的是葉（圖7）。

3討論

MVA途徑能夠?yàn)榈猃埬懰幮С煞铸埬懣嘬盏纳锖铣商峁┣绑w物質(zhì)。MK是MVA途徑的第一個(gè)限速酶[6，11]，因此，滇龍膽中GrMK基因的表達(dá)情況直接或間接影響龍膽苦苷的生物合成。研究表明，植物中MK蛋白如三七PnMVKlc[11]、林煙草NsMKc[13]、杜仲ELIMK[1 2]均包含GHMP激酶N端、C端結(jié)構(gòu)域和ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本研究從滇龍膽幼葉中克隆了GrMK基因，蛋白序列比對(duì)分析結(jié)果表明GrMK蛋白屬于MK家族蛋白，在其N端、中部和C端分別具有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：GHMP激酶N端結(jié)構(gòu)域（133-212）、GHMP激酶ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（138-149）和GHMP激酶C端結(jié)構(gòu)域（294-350）。這些結(jié)果表明所克隆基因?yàn)榈猃埬懠琢u戊酸激酶基因。

基因編碼蛋白的活性形式和亞細(xì)胞定位對(duì)蛋白功能執(zhí)行都有很大影響。在生物界，MK活性蛋白以單體或二聚體的形式在體內(nèi)起作用。在詹氏甲烷球菌中，MjMK單體蛋白為36.00 kD，而其活性形式為二聚體，相對(duì)分子質(zhì)量為68.00 kD[19]；在長(zhǎng)春花中，其蛋白單體和活性形式相對(duì)分子質(zhì)量分別為40.50 kD和104.60 kD；在釀酒酵母中，其單體蛋白即為其活性形式，相對(duì)分子質(zhì)量為40.80 kDc20]。在本研究中，GrMK單體相對(duì)分子質(zhì)量為41.12 kD.其活性形式需要通過非變性SDS-PAGE進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。在人類、擬南芥和長(zhǎng)春花中，MK蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)[3，8，21]。在本研究中，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明GrMK蛋白定位于細(xì)胞核的可能性最大，這與三七PnMK蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果一致[11]但該結(jié)果與其功能作用并不相符，需通過融合GFP標(biāo)簽進(jìn)一步驗(yàn)證其亞細(xì)胞定位。在擬南芥整個(gè)發(fā)育過程中，AtMK基因在各個(gè)組織中均表達(dá)，但在根分生組織中表達(dá)量最高[22]。組織表達(dá)特異性檢測(cè)結(jié)果表明，Gr MK基因在根中表達(dá)量最高，因此推測(cè)滇龍膽根部為MVA途徑較為活躍，并為龍膽苦苷生物合成提供前體物質(zhì)。滇龍膽用藥部分為根，因?yàn)榕c葉和莖相比，根中龍膽苦苷含量最高[23]這也為上述假說提供了證據(jù)。

本研究為滇龍膽GrMK基因功能的解析奠定基礎(chǔ)。下一步將對(duì)GrMK蛋白進(jìn)行純化和酶活分析，通過互補(bǔ)試驗(yàn)或過表達(dá)研究Gr MK基因功能，為龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理的闡明奠定基礎(chǔ)。