劉臘蘭 彭波 黃超洋 唐菁菁 方芳 常海艷 張風(fēng)華

摘要：表達(dá)巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）即刻早期蛋白（IE-1）的DNA疫苗能抵抗巨細(xì)胞病毒的感染。β防御素2型（BD2）能激活未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)。以小鼠為動(dòng)物模型，探討小鼠13D2（mBD2）增強(qiáng)鼠巨細(xì)胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV） IE-1 DNA疫苗的佐劑效果。將表達(dá)IE-1的質(zhì)粒（pIE-l）與表達(dá)mBD2的質(zhì)粒（pBD2）混合免疫小鼠，2周后用致死量的同源MCMV攻擊小鼠。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，混合免疫pIE-l和pBD2的小鼠與單獨(dú)免疫IE-1相比，血清中IE -1特異性抗體含量升高，脾臟CD8+T細(xì)胞所分泌的IFN-y水平上升，小鼠體重丟失明顯下降，病毒攻擊后小鼠存活率也有所提高。這些結(jié)果表明，BD2可以作為一種分子佐劑增強(qiáng)IE-1 DNA疫苗的免疫效果。

關(guān)鍵詞：巨細(xì)胞病毒；即刻早期蛋白；DNA疫苗；p防御素2型

中圖分類號(hào)：R373.1+3； 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）03-0224-05

巨細(xì)胞病毒（ cytomegalovirus，CMV）是一類雙鏈DNA病毒，屬于β皰疹病毒亞科。CMV可致多種哺乳動(dòng)物感染，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等損傷。人巨細(xì)胞病毒（ human cytomegalovirus，HCMV）在人群中普遍易感，但一般沒(méi)有明顯的臨床癥狀，而在免疫低下的AIDS患者、免疫抑制的器官移植患者或嬰幼兒中，HCMV可引起嚴(yán)重的臨床癥狀甚至導(dǎo)致死亡[1，2]。目前還沒(méi)有HCMV疫苗在臨床上使用，有效預(yù)防感染的HCMV疫苗是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。已經(jīng)進(jìn)入臨床2期試驗(yàn)的HCMV疫苗只有兩種：聯(lián)合新型MF59佐劑的包膜糖蛋白gB亞單位疫苗和pp65與gB DNA二價(jià)疫苗[3，4]。巨細(xì)胞病毒即刻早期蛋白（IE-1）DNA疫苗作為研究對(duì)象之一，單獨(dú)免疫機(jī)體時(shí)不能提供很好的保護(hù)。因此，尋找一種合適有效的佐劑來(lái)增強(qiáng)其免疫效果很有必要。

防御素作為機(jī)體防御系統(tǒng)的成分，是一類富含精氨酸和半胱氨酸的小分子多肽。防御素除了抗病原微生物和抗毒素作用外，還具有抗病毒作用，能在對(duì)抗單純皰疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒等包膜病毒感染中發(fā)揮作用[5，6]。此外防御素還具有免疫調(diào)節(jié)作用，小鼠BD2 （mBD2）能通過(guò)TLR4受體來(lái)促進(jìn)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟；人β防御素3型（hBD3）能通過(guò)TLR1和TLR2誘導(dǎo)CD80、CD86和CD40在髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞表面的表達(dá)[7]。防御素除了與趨化因子受體及Toll樣受體共同作用外，還能誘導(dǎo)表達(dá)大量的細(xì)胞因子和促炎因子如TNF-a、IFN-y、IL-2、IL-8和IL-18等，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[8，9]。

為探明BD2對(duì)IE-1 DNA疫苗免疫效價(jià)的影響，以小鼠為動(dòng)物模型，將表達(dá)mBD2的質(zhì)粒（ pBD2）與表達(dá)IE-1的質(zhì)粒（pIE-l）混合免疫BALB/c小鼠，通過(guò)檢測(cè)小鼠的血清抗體、脾臟IFN-γ、存活率、體重丟失及器官病毒滴度來(lái)評(píng)價(jià)BD2對(duì)IE-1 DNA疫苗的佐劑效果。

1 材料與方法

1.1 病毒與小鼠

MCMV的Smith株由本實(shí)驗(yàn)室保存，小鼠體內(nèi)擴(kuò)增傳代。實(shí)驗(yàn)中所用小鼠為6～8周齡的SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠（由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)）。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)中所用的pIE-l DNA疫苗由本實(shí)驗(yàn)室人員構(gòu)建，系將MCMV Smith株IE1基因插入pcDNA3.1真核表達(dá)載體中得到[10]。

小鼠β防御素2型（mBD2）基因由上海生物制品所提供（GenBank登錄號(hào)為No. AJ011800）。利用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工生物公司合成。其中正向引物mBD2-F： CGgaattcCTCT-CTGGAGTCTGAGTGCC，反向弓l物mBD2-R： GC-LctagaTTTATTGAAACATCAATTACACATC.mBD2的PCR反應(yīng)體系為：高滅純水16.8 μL，Pfu Buffer2.5 μL，dNTP 2.5 μL，cDNA模板1 μL，mBD2sense primer 1 μL，mBD2 anti-sense primer lμ1，Pfu酶0.2 μL。PCR反應(yīng)條件：變性94 °C 30 s，退火55 度C 30 s，延伸72 度C 45 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物回收后，插入pCDNA3.1真核表達(dá)載體，構(gòu)建pcDNA3.1-mBD2的重組質(zhì)粒（以下簡(jiǎn)稱pBD2）。

1.3免疫與攻毒

實(shí)驗(yàn)共分為4個(gè)組，其中3組分別免疫50μg pIE-l、10μg pBD2和50 μg pIE-l +10 μgpBD2，剩下一組不免疫作為陰性對(duì)照。免疫的方法均為肌肉注射輔以電穿孔法l¨I。免疫兩周后，用致死量（3xLDso） MCMV腹腔感染小鼠。攻毒后的21 d內(nèi)觀察小鼠體征變化，并記錄每組小鼠體重丟失情況和死亡情況。

1.4 IE-1特異性抗體檢測(cè)

免疫兩周后，剪尾取血收集血清樣本，ELISA法檢測(cè)IE1特異性抗體含量。96孔板中反應(yīng)物依次加入：1）含IE1蛋白的包被液；2）連續(xù)2倍稀釋的血清；3）生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體；4）堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈菌蛋白；5）pNPP顯色液；6）酶標(biāo)儀中測(cè)出波長(zhǎng)為405～450 nm處的吸光值。以對(duì)照組血清吸光值的x+2s作為實(shí)驗(yàn)組血清抗體陽(yáng)性的臨界值。

1.5脾臟細(xì)胞分泌IFN-y檢測(cè)

免疫10 d后，無(wú)菌操作摘取小鼠脾臟，分離脾臟淋巴細(xì)胞用于檢測(cè)IFN-γ的量。使用深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司的Mouse IFN-y Pre-coated ELISPOT kit并按使用說(shuō)明操作如下：1）96孔ELISPOT包被板的活化；2）每孔按2xl05加入細(xì)胞懸液；3）每孔加入4μg的MCMV IE-1抗原的CD8T細(xì)胞表位肽168-YPHFMPTNL-176（H2d限制型，由上海生工生物技術(shù)公司合成）；4）37 0C，5% C02培養(yǎng)箱孵育20 h；5）冰冷的去離子水裂解細(xì)胞；6）加人生物素標(biāo)記的二抗孵育；7）加入酶聯(lián)親和素孵育；8） AEC顯色液顯色；9）終止顯色；10） ELISPOT斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。讀板所得斑點(diǎn)數(shù)用于分析脾臟細(xì)胞分泌IFN-y的情況，以此評(píng)價(jià)小鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫水平。

1.6器官病毒滴度測(cè)定

攻毒后的第5d與第21 d，收集小鼠脾臟和唾液腺，病毒稀釋液冰上無(wú)菌研磨，勻漿液離心后，上清-80 0C保存。24孔板中的NIH-3T3細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，勻漿上清按10倍系列稀釋后，各稀釋度按每孔100 μL感染3T3細(xì)胞。5% C0237 0C孵育th后加入粘性培養(yǎng)基。待細(xì)胞形成明顯的病毒斑時(shí)，根據(jù)每孔中病毒斑的數(shù)目，計(jì)算出各樣本器官中的病毒滴度（ pfu/mL），每組小鼠病毒滴度值以x±s值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的評(píng)定用Student's test方法，以P<0.05定為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。存活率是否有意義用Fisher's exact test方法比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠來(lái)確定。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 混合免疫pIE-l和pBD2后IE-1特異性抗體檢測(cè)

小鼠免疫一次，免疫2周后，剪尾取血收集小鼠血清，用ELISA的方法檢測(cè)抗IE-1特異性IgG抗體。如表1所示，小鼠經(jīng)pIE-l單獨(dú)免疫后可以檢測(cè)到血清特異性IgG抗體，經(jīng)pIE-l和pBD2混合免疫后小鼠血清中IgG抗體滴度升高，與單獨(dú)的pIE—l免疫組相比具有顯著差異，說(shuō)明mBD2對(duì)IE-1 DNA疫苗在小鼠體內(nèi)抗體應(yīng)答有免疫增強(qiáng)作用。

2.2 混合免疫pIE一1和pBD2后小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)

免疫10 d后用ELISPOT的方法檢測(cè)小鼠體內(nèi)分泌IFN-y的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量，ELISPOT斑點(diǎn)數(shù)代表IE-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。如圖1所示，混合免疫pIE-l和pBD2組及單獨(dú)免疫pIE-l組小鼠分泌IFN-y的脾臟細(xì)胞量均比對(duì)照組高，兩者與對(duì)照組相比均有顯著性差異。且混合免疫pIE-l和pBD2后小鼠體內(nèi)分泌IFN-γ的脾臟細(xì)胞數(shù)目明顯提升，達(dá)到每2xl05個(gè)脾臟細(xì)胞805個(gè)斑點(diǎn)，與單獨(dú)免疫pIE-l組小鼠（每2xl05個(gè)脾臟細(xì)胞438個(gè)斑點(diǎn)）相比有顯著性差異。說(shuō)明pBD2質(zhì)粒混合pIE-l DNA疫苗免疫小鼠后，能增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)。

2.3致死劑量病毒攻擊后小鼠存活率及器官病毒滴度

免疫2周后用致死劑量同源病毒攻擊小鼠，攻毒后21 d內(nèi)觀察各組小鼠的死亡情況。如圖2中所示，空白對(duì)照組與pBD2單獨(dú)免疫組小鼠，均在攻毒后7d內(nèi)全部死亡。單獨(dú)免疫pIE-l對(duì)小鼠的保護(hù)率為400/0，而混合免疫pIE-l和pBD2對(duì)小鼠的保護(hù)率達(dá)到700/0，混合免疫組與對(duì)照組小鼠存活率相比有顯著性差異。攻毒后第5d和第21 d分別取小鼠脾臟和唾液腺，噬斑測(cè)定法檢測(cè)攻毒后小鼠臟器中的病毒滴度。結(jié)果如表2所示，混合免疫pIE-l和pBD2的小鼠攻毒后體內(nèi)的病毒滴度明顯比單獨(dú)免疫pIE-l的小鼠低，兩者相比有顯著性差異。且小鼠單獨(dú)免疫pBD2，攻毒后脾臟病毒滴度也比對(duì)照組小鼠低，兩者相比也有顯著性差異。結(jié)果表明mBD2能增強(qiáng)IE-1DNA疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)作用，mBD2也具有抗病毒作用。

2.4 攻毒后小鼠體重變化

以病毒攻擊小鼠當(dāng)天作為第Od，當(dāng)天體重視為原始體重，21 d內(nèi)小鼠體重丟失值與原始體重的比值作為體重丟失率。結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組小鼠及pBD2免疫的小鼠第5d時(shí)體重丟失達(dá)到30%以上，pIE-l單獨(dú)免疫的小鼠體重丟失達(dá)到26%，而混合免疫pIE-l和pBD2的小鼠體重丟失雖也達(dá)到240/0，但第7d時(shí)體重開(kāi)始回升，而單獨(dú)免疫pIE-l組小鼠體重7d之后才開(kāi)始回升。說(shuō)明pIE-l和pBD2混合免疫小鼠后，能降低小鼠體重丟失，加速感染后的體重恢復(fù)。

3討論

在本研究中我們用pIE一1 DNA疫苗與pmBD2質(zhì)粒共同免疫BALB/c小鼠，兩周后用致死劑量同源病毒攻擊。二者共同免疫的小鼠與IE-1 DNA疫苗單獨(dú)免疫組相比，IE-1特異性抗體滴度增加且小鼠脾臟中分泌IFN -y的淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯增多。攻毒后混合免疫組小鼠體內(nèi)殘留的病毒滴度比pIE-l單獨(dú)免疫組低；且混合免疫對(duì)小鼠抗致死劑量MCMV感染的保護(hù)率比pIE-l組高。這些結(jié)果均可以證明mBD2作為IE-1 DNA疫苗的分子佐劑，能起到免疫調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)。

巨細(xì)胞病毒即刻早期蛋白IE-1，是病毒感染宿主后表達(dá)的早期基因產(chǎn)物。鼠巨細(xì)胞病毒IE-1蛋白，能在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)IE一1特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)小鼠抵御MCMV感染有一定的保護(hù)作用[12]。我們之前關(guān)于巨細(xì)胞病毒DNA疫苗在BALB/c小鼠中免疫效果的比較，發(fā)現(xiàn)100 μgpIE-l DNA疫苗單獨(dú)一次免疫小鼠時(shí)，對(duì)小鼠抗致死劑量MCMV感染的保護(hù)率為68%[10]。而50 μgpIE-l DNA疫苗單獨(dú)一次免疫小鼠時(shí)，對(duì)小鼠抗致死劑量MCMV感染的保護(hù)率只有50%[13]。在我們的試驗(yàn)中，50 μg pIE-l DNA疫苗與10 μgpBD2質(zhì)?；旌厦庖咝∈髸r(shí)，對(duì)小鼠抗致死劑量MCMV感染的保護(hù)率達(dá)到70%，比100 μg pIE-lDNA疫苗單獨(dú)一次免疫對(duì)小鼠的保護(hù)率更高。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Valtanen等的研究結(jié)果一致。他們用2μg表達(dá)斑馬魚(yú)β防御素2型（zfBD2）的質(zhì)粒免疫斑馬魚(yú)后用鯉春病毒（SVCV）攻擊，被感染的斑馬魚(yú)的病毒滴度要比對(duì)照組的低20倍。此外，用1μg gpG DNA疫苗與0.5 μg zfBD2質(zhì)粒共同免疫斑馬魚(yú)，后用SVCV病毒攻擊，對(duì)斑馬魚(yú)的保護(hù)率明顯提高，甚至比10 μg的DNA疫苗單獨(dú)免疫斑馬魚(yú)的保護(hù)率更高[14]。Biragyn等的實(shí)驗(yàn)證明，用表達(dá)hBD2的HIV gP120 DNA疫苗免疫小鼠，能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)全身性和粘膜免疫的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)[15]在老年鼠模型中mBD2能刺激機(jī)體分泌高水平的INF-y提高細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)HAd-HA-NP疫苗對(duì)小鼠抗H5Nl的保護(hù)效果[16]。而我們的實(shí)驗(yàn)中混合免疫pIE-l和pBD2也能提高小鼠分泌INF-Y的水平，增強(qiáng)機(jī)體CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。Gong等發(fā)現(xiàn)，用重組的鼠β防御素2型（rmBD2）處理過(guò)的PR-8病毒去攻擊小鼠時(shí)，小鼠的死亡率只有300/0。而用未處理的病毒去攻擊小鼠，小鼠的死亡率達(dá)到l00%[17]；Sun等發(fā)現(xiàn)人β防御素不僅能直接滅活HIV病毒，且hBD2能抑制HIV病毒在細(xì)胞內(nèi)的傳播唑而我們的實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)免疫10 μg pBD2的小鼠脾臟病毒滴度比對(duì)照組低，兩者相比有顯著性差異，也說(shuō)明mBD2具有抗病毒效果。

防御素之所以能起到免疫調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，很有可能是因?yàn)樗茉诿庖卟课荒技疍C細(xì)胞，而DC細(xì)胞能直接激活趨化因子受體，而且在先天性免疫和獲得性免疫之間具有重要的橋梁作用[19]。DC細(xì)胞最大的特點(diǎn)就是能夠顯著性刺激初始T細(xì)胞增殖，因此DC細(xì)胞是機(jī)體適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動(dòng)者。而研究表明，hBD3通過(guò)CCR7受體促進(jìn)朗格漢斯樣細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞（LC -DCS）的成熟，增強(qiáng)CCL19和CCL21的趨化反應(yīng)并促進(jìn)初始T細(xì)胞分泌IFN-γ[20]。mBD2可通過(guò)CCR6受體來(lái)趨化和聚集iDC和其他的免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞、NK細(xì)胞[21]。mBD2能結(jié)合TLR4受體促進(jìn)iDC的成熟，DC分泌IL-12誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為T(mén)hl型細(xì)胞。Thl分泌IFN -y、TNF-α、IL-2、IL-3等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，從而增強(qiáng)機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體的水平及有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)[22，23]。

本研究在小鼠模型上證明了mBD2可以作為分子佐劑增強(qiáng)巨細(xì)胞病毒IE-1DNA疫苗的免疫應(yīng)答，提高小鼠對(duì)致死量病毒感染的免疫保護(hù)能力。該結(jié)果為人類巨細(xì)胞病毒疫苗的研究提供了實(shí)驗(yàn)參考。