羅宇霞，康德燦*，陳彩霞，劉 玉，肖亞琪

（西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）是一種極其珍貴的食、藥用真菌，富含蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、生物堿、各種維生素和20多種礦質(zhì)元素，具有抑菌、降血糖、抗疲勞、抗腫瘤、提高免疫力等很多藥用功效[1-3]。魔芋（Amorphophallus konjac）的主要成分為葡甘聚糖（konjak glucomannan，KGM），是理想的膳食纖維，不含熱量，有飽腹感，具有減肥、改善腸道環(huán)境、抗氧化等功能[4]。葡甘聚糖還具有持水增稠、懸浮、膠凝、黏接、成膜等多種獨(dú)特的理化性質(zhì)而使其具有廣泛的應(yīng)用和開發(fā)價(jià)值，由魔芋葡甘聚糖、海藻酸鈉和其他潤(rùn)滑劑、增塑劑等制備的膜材料，可用于控制藥物的釋放[5-6]。天然的冬蟲夏草十分稀少，難以滿足保健和用藥的要求，所以蟲草真菌人工培養(yǎng)顯得尤為必要。作為魔芋提取物羧甲基魔芋膠的氯乙酸醚化改性產(chǎn)物，已被作為載體材料用于納米粒給藥系統(tǒng)的制備[7]。

1932 年，小林義雄等[8]首次在米飯培養(yǎng)基上成功獲得蛹蟲草子座，拉開了米飯培養(yǎng)基栽培蛹蟲草的序幕。張顯科等[9-12]研究學(xué)者，先后以大米、小米、玉米、小麥等培養(yǎng)基培養(yǎng)出蛹蟲草子座。人工培養(yǎng)蟲草主要采取人工栽培和液體培養(yǎng)兩種方法[13]，在人工栽培時(shí)，根據(jù)栽培容器，可分為瓶栽、袋栽及盒栽3種，近幾年來發(fā)展運(yùn)用最多的是盆栽法[14-15]，但固體栽培具有培養(yǎng)周期長(zhǎng)、環(huán)境條件不易控制、培養(yǎng)基無(wú)法給蟲草菌注入新營(yíng)養(yǎng)的缺陷；而液體發(fā)酵培養(yǎng)蟲草又具有污染率高，子實(shí)體產(chǎn)量低而不穩(wěn)，風(fēng)險(xiǎn)大等缺點(diǎn)；導(dǎo)致人工培養(yǎng)蟲草仍未建立完善的生產(chǎn)模式。

本試驗(yàn)將魔芋精粉經(jīng)過加水熱溶、加堿改性制成凝膠，經(jīng)高壓、高溫、膨化處理，在低溫冷凍條件下制成可食懸浮式改性載體。將魔芋載體漂浮于液體培養(yǎng)基上層，在魔芋載體上接種蟲草菌，隨著其菌絲體生長(zhǎng)，魔芋載體均勻吸收液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)，不斷地向蟲草菌提供液體中的營(yíng)養(yǎng)和魔芋本體中的營(yíng)養(yǎng)。采用改性魔芋載體培養(yǎng)蟲草能在較短時(shí)間生產(chǎn)出蟲草菌絲體，出草成熟后將載體及菌絲體同時(shí)收獲，可獲得兼具蟲草、魔芋兩者藥用價(jià)值的復(fù)合功能型保健材料，極具有開發(fā)潛力。本研究為中小保健食品企業(yè)開創(chuàng)了一種新型的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大邑蟲草菌種（Cordyceps dayigensis，CD）、廣東蟲草菌（Cordyceps guangdongensis，CG）、四川蟲草菌株（Cordyceps sichuangensis，CS）：華能生物科技公司。

1.1.2 主要試劑

魔芋精粉（食品級(jí)）：四川省農(nóng)副產(chǎn)品加工技術(shù)開發(fā)公司成都分公司；食用蔗糖、麥麩、蠶蛹粉：市售；酵母膏：上海乾勁化工科技有限公司；VB1（分析純）：威清南波灣生物技術(shù)有限公司；蛋白胨：上海乾勁化工科技有限公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂均為分析純：南京化學(xué)試劑股份有限公司；聚氨酯海綿：蘇州市天啟聚氨脂制品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體斜面培養(yǎng)基：麥麩20 g、硫酸鎂0.5 g、蔗糖20 g、磷酸二氫鉀1.5 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g、蠶蛹粉1 g、VB14g，蠶蛹粉1 g，再加入瓊脂粉15 g煮沸，加水定容至1 000 mL，調(diào)pH 7.2，分裝18×180 mm試管，120 ℃、0.1 MPa滅菌30 min，放置成斜面冷凝備用。

液體培養(yǎng)基：麥麩20 g、蔗糖20 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g、VB14 g。加水定容至1 000 mL，調(diào)pH 6.0～6.5，分裝于200 mL三角瓶，120 ℃、0.1 MPa滅菌30 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

JY-1002型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；YM100Z智能型立式壓力蒸汽滅菌器：上海嘉措儀器設(shè)備有限公司；DHP-9012A電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BZF-30真空干燥箱：上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蟲草菌種的活化

將蟲草菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，置24 ℃下恒溫黑暗培養(yǎng)7～10 d，讓斜面長(zhǎng)滿菌絲。觀察可見菌絲生長(zhǎng)濃密旺盛，先呈白色絨毛狀，隨后變成淺桔黃色。

1.3.2 可食懸浮式改性魔芋載體的制備

在高溫（100 ℃）、強(qiáng)堿（pH 12）條件下，魔芋精粉與水比例為1∶35（g∶mL）制作凝膠過程中，葡甘聚糖支鏈上的乙?；撾x，分子間聯(lián)結(jié)成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)眼間保持著不能自由流動(dòng)的水分，使該物系成具彈性的半固體狀[16-18]，充分體現(xiàn)了葡甘聚糖的賦形性及持水保水性，形成的凝膠經(jīng)高壓、高溫不能再恢復(fù)到流體狀態(tài)，由于這種熱不可逆性，可以作為蟲草液體懸浮培養(yǎng)的載體。在脫乙酰反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)向其中加入碳酸氫鈉（食品級(jí)），能使這種葡甘聚糖體內(nèi)布滿細(xì)小均勻的孔徑，將改性制成后的凝膠經(jīng)過超低溫冷凍、脫水，干燥后形成海綿狀的載體，能平穩(wěn)漂浮在液體表面，均勻綿延吸收液體中的養(yǎng)分。

（1）魔芋載體制作工藝流程

魔芋精粉→加水→煮沸→加入碳酸鈉→加入碳酸氫鈉→高速攪拌→倒入固形容器→冷凝成型→清水漂洗→沸水焯煮→老化蒸煮→凝膠速凍→解凍→烘干→多孔載體

（2）操作要點(diǎn)：

a.魔芋凝膠初制

當(dāng)水溫升至50～70 ℃后，取不同魔芋載體配方加入300 mL蒸餾水中，加熱攪動(dòng)，使之逐漸熟化，與水融為一體。煮沸約30 min魔芋葡甘聚糖充分熟化溶脹后，及時(shí)加入碳酸鈉，促使容器內(nèi)物料加速熟化溶脹，化清，凝固?？焖偌尤胩妓釟溻c，在加入碳酸氫鈉瞬間后，10～15 s內(nèi)，要快速﹑高速攪拌流質(zhì)濃料，盡可能多的將空氣攪進(jìn)物料，以形成氣泡從而增加載體孔徑，使載體能夠很好懸浮。然后要迅速將流質(zhì)濃料倒入固形容器內(nèi)，等待物料在室溫下自然冷卻凝固。

用木筷垂直插入檢查凝膠是否已完全成型。如木筷插入后垂立不倒，拔出后留孔不閉合，筷子上不粘膠狀物，說明凝膠已全部成型。用清水漂除余堿。用沸水焯煮除去余堿，再用冷水漂洗，反復(fù)2～3次得到多孔魔芋凝膠。

b.魔芋凝膠的老化

先將固定容器內(nèi)的魔芋糕用80 ℃左右的水溫，蒸煮10～12 min，使產(chǎn)品的韌性和強(qiáng)度增加，含堿量均勻適度。

參考李娟的實(shí)驗(yàn)方法，采用Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀對(duì)空白和加酶全麥粉的熱機(jī)械學(xué)特性參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)條件選用 Chopin+標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)前，首先需對(duì)待測(cè)粉樣的水分含量進(jìn)行測(cè)定。整個(gè)測(cè)試過程獲得的參數(shù)（C1、C2、C3、C4、C5、α、β、γ）釋義見文獻(xiàn)[12]。

c.魔芋凝膠的固形

將老化后形狀規(guī)則的制品從容器中取出，在沸水中煮5～10 min，形成固定的形狀。

d.魔芋凝膠的冷凍

魔芋凝膠速凍后冰晶粒的增大，使魔芋凝膠變?yōu)楹Ｃ逘钆菽瓪馊苣z。冷凍是懸浮載體制作的關(guān)鍵工序，分3個(gè)階段進(jìn)行。

第一階段：將固形后的制品，采用冷風(fēng)、冷水以及自然降溫的方法，使其溫度逐漸降低到常溫以下。

第二階段：將冷卻過的制品，及時(shí)迅速轉(zhuǎn)入冰箱冷藏室，用5 ℃左右的溫度，經(jīng)15～30 h，進(jìn)行預(yù)凍處理。

第三階段：將預(yù)凍制品迅速轉(zhuǎn)人冷凍室，用-18～-20 ℃的溫度，冷凍至少48～72 h。

e.魔芋凝膠的烘干

將冷凍后的魔芋凝膠烘干，烘干后按照廣口玻璃瓶的大小剪成圓形，逐個(gè)稱重、標(biāo)記、記錄，使用聚氨酯海綿作為對(duì)照。在0.1 MPa、121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。將高壓滅菌后的魔芋載體和聚氨酯海綿載體用干燥箱在60 ℃烘干，置真空干燥器中干燥至質(zhì)量恒定，備用。

1.3.3 魔芋載體綜合評(píng)價(jià)

選取6名研究人員組成評(píng)定小組，進(jìn)行綜合評(píng)分。評(píng)分依據(jù)有孔徑、浮力、吸水性、柔韌性、成形效果5個(gè)方面，按照權(quán)重進(jìn)行綜合評(píng)分，孔徑和浮力各占30%，吸水性占20%、柔韌性，成形效果各占10%，滿分為10分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 魔芋載體的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of Amorphophalms konjac carrier

1.3.4 魔芋載體配方正交優(yōu)化試驗(yàn)

查閱大量文獻(xiàn)，在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選魔芋精粉、米粉、碳酸鈉和碳酸氫鈉最佳配方，以魔芋載體綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用4因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平見表2。

表2 載體配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for carrier formula optimization

1.3.5 接種與培養(yǎng)

由于魔芋載體和聚氨酯海綿載體都具有孔徑細(xì)密、液體吸收力強(qiáng)、浮力好等相似的結(jié)構(gòu)和性狀，本試驗(yàn)采用聚氨酯海綿載體作為魔芋載體的對(duì)照。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將魔芋載體和聚氨酯海綿載體放入編號(hào)的廣口瓶液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基深約2 cm。將長(zhǎng)滿蟲草菌絲的斜面培養(yǎng)基分割成1 cm2見方的小塊，然后分別挑入廣口瓶，置于魔芋載體及海綿載體上。每瓶呈對(duì)角線均等放置4塊。接種CS（四川蟲草菌株）、CD（大邑蟲草）、CG（廣東蟲草）菌種，每種蟲草做3個(gè)平行，一個(gè)對(duì)照。

接種完畢后，將已接種的廣口瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中24 ℃黑暗培養(yǎng)7 d左右，使菌絲體布滿載體表面，放入培養(yǎng)箱的前3 d要求每天觀察一次，及時(shí)清除污染瓶。待菌絲長(zhǎng)滿載體表面后，施以200 lx強(qiáng)度的光照，持續(xù)培養(yǎng)7～10 d，使菌絲體由白色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榻埸S色，此時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)光照時(shí)間，促使菌絲體轉(zhuǎn)色、刺激原基形成。蟲草原基形成后繼續(xù)培養(yǎng)10 d左右，原基開始分化成子座。

1.3.6 子實(shí)體的采收

接種培養(yǎng)兩個(gè)月后可見子實(shí)體長(zhǎng)成上粗下細(xì)的棒狀，頂端出現(xiàn)小的突起，且表面出現(xiàn)粒狀粉末時(shí)，這表明子實(shí)體成熟[19]。子實(shí)體成熟后，小心將子實(shí)體和載體一起采收。濾去培養(yǎng)液后，放入干凈的培養(yǎng)皿中，置于真空干燥箱內(nèi)在50 ℃下烘干至恒質(zhì)量，采用重量法測(cè)定其生物量，記錄數(shù)據(jù)。生物量計(jì)算公式如下：

蟲草干質(zhì)量=載體與子實(shí)體烘干物干質(zhì)量－載體干質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋載體配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇魔芋精粉（A）、米粉（B）、碳酸鈉（C）和碳酸氫鈉（D）為試驗(yàn)影響因素，以魔芋載體綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 載體配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for carrier formula optimization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3通過極差R分析可得，各因素對(duì)魔芋載體效果影響的主次順序?yàn)镈＞A＞C＞B，即碳酸氫鈉含量＞魔芋精粉含量＞碳酸鈉含量＞米粉含量。制作懸浮式魔芋載體的最佳配方組合為A2B2C3D3，即魔芋精粉2.0%、米粉2.5%、碳酸鈉0.5%、碳酸氫鈉0.5%。在此最佳載體配方條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，載體綜合評(píng)價(jià)為9.6分。此配方制作的載體浮力很好，能平穩(wěn)的漂浮在水面上；質(zhì)地軟硬強(qiáng)度適中；柔韌性好不易變形；載體內(nèi)有均勻的細(xì)小海綿狀孔徑且孔隙大小均衡；經(jīng)過干燥后吸水效果好能綿延吸收水溶性營(yíng)養(yǎng)。

由表4可知，A、B、D因素對(duì)綜合評(píng)分的作用影響顯著，C因素對(duì)綜合評(píng)分的作用影響不顯著。因此在篩選魔芋載體配方時(shí)要注意調(diào)節(jié)碳酸氫鈉、魔芋精粉以及米粉的含量。

2.2 生物量測(cè)定及分析

待蟲草子實(shí)體長(zhǎng)成上粗下細(xì)的棒狀，頂端出現(xiàn)小的突起，且表面出現(xiàn)粒狀粉末時(shí)表明子實(shí)體已經(jīng)成熟，小心將蟲草子實(shí)體和載體一起采收。濾去培養(yǎng)液后，放入干凈的培養(yǎng)皿中，在50 ℃條件下置于真空干燥箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，計(jì)算其生物量，結(jié)果見表5，兩種載體蟲草生物量比較結(jié)果見圖1。

表5 蟲草生物量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of Ophiocordyceps sinensis biomass

圖1 蟲草干物質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of dry Ophiocordyceps sinensis biomass

圖1結(jié)果表明，在3個(gè)蟲草品種中，海綿載體與魔芋載體的蟲草干質(zhì)量呈現(xiàn)極顯著（P＜0.01）的差異，魔芋載體的四川蟲草與廣東蟲草之間差異不顯著（P＞0.05），而大邑蟲草與四川蟲草和廣東蟲草之間差異顯著（P＜0.05）。這說明使用魔芋載體培養(yǎng)蟲草的生物量明顯高于海綿載體，魔芋載體更適合培養(yǎng)蟲草。

3 結(jié)論

天然的冬蟲夏草十分稀缺，難以滿足食用和藥用需求，人工栽培顯得尤為重要。本試驗(yàn)利用正交試驗(yàn)優(yōu)化了懸浮式魔芋載體的制作配方。結(jié)果表明，影響魔芋載體性能的主要因素是碳酸氫鈉含量和魔芋精粉含量，其次是碳酸鈉含量，影響最小的是米粉含量。制作魔芋載體的最佳配方為魔芋精粉2.0%、米粉2.5%、碳酸鈉0.5%、碳酸氫鈉0.5%。試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的改性魔芋葡甘聚糖載體懸浮性和內(nèi)在孔徑等性能都相當(dāng)好，能懸浮在液體培養(yǎng)基表面，不必再采用機(jī)械支架支撐，實(shí)現(xiàn)真正的載體懸浮培養(yǎng)，達(dá)到了試驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

通過與海綿載體的對(duì)比，結(jié)果顯示，懸浮式魔芋載體培養(yǎng)的蟲草菌生物量明顯高于海綿載體，且與傳統(tǒng)的人工栽培蟲草相比，具有生產(chǎn)周期短、設(shè)備簡(jiǎn)單、投入成本低、見效快、綠色天然等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蟲草藥療保健品，開發(fā)中國(guó)的藥食資源，探索了一條可行途徑。但如何保持蟲草的優(yōu)良遺傳性狀，將模型擴(kuò)大成塑料盒式栽培，采用工業(yè)化的生產(chǎn)模式擴(kuò)大懸浮式載體，進(jìn)一步增加蟲草菌體的產(chǎn)量，還有待進(jìn)一步探索。

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