徐 佳，高 萌

（江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004）

桑葚（Fructus mori）是?？粕僦参锍墒旃氲慕y(tǒng)稱（又名桑果），營養(yǎng)價(jià)值很高，既可食用又可入藥，且汁濃似蜜，香甜可口，被譽(yù)為“民間圣果”[1]。桑葚果實(shí)中含有1.17%的蛋白質(zhì)、2.15%的脂肪、4.4%的糖類、6.6%的可溶性固形物、0.47%的礦物質(zhì)、0.56%的有機(jī)酸。此外，還富含維生素（如VC、VB1、VB2）及胡蘿卜素等[2]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，桑葚能補(bǔ)益肝腎、黑發(fā)明目、養(yǎng)血生津[3]。鑒于桑葚的諸多營養(yǎng)保健功能，被衛(wèi)生部正式列為首批“既是食品又是藥品”的名單[1]。

與糧食醋相比，果醋富含有機(jī)酸和維生素，其營養(yǎng)保健功能和口感更佳。桑葚果醋以新鮮壓榨的桑葚果汁為主要原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而成，不僅包含一般食醋的保健功能，而且具有桑葚的生理功能，如解除疲勞，消除肌肉疼痛，降低血壓，分解血膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈硬化和心血管病的發(fā)生，增加食欲，促進(jìn)消化，保護(hù)皮膚等作用[4]。隨著我國消費(fèi)者營養(yǎng)保健意識(shí)的日益增強(qiáng)，對(duì)營養(yǎng)保健品的需求也越來越高，桑葚加工成的食品目前卻未很好地被開發(fā)利用[5]，然而它所具有較高的醫(yī)療保健功能，必定能在國內(nèi)市場(chǎng)上受到廣大消費(fèi)者的青睞[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

桑葚：市購。

1.1.2 菌種

醋酸菌A32：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地；安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酒精發(fā)酵基本培養(yǎng)基：將處理好的桑葚汁用蔗糖調(diào)整至所需糖度，用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)其pH值至4，于250 mL三角瓶分裝100 mL，80 ℃滅菌10 min[7]。

醋酸發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1%葡萄糖，1%酵母膏，調(diào)pH值至5.5，121 ℃滅菌15 min冷卻至70 ℃后移加4%vol的無水乙醇[8]。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-SG46-280S全自動(dòng)高壓滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；XHZ-30臺(tái)式恒溫?fù)u床：上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱：上海合恒儀器設(shè)備有限公司；WW163附溫糖度計(jì)：深圳博大精科實(shí)業(yè)有限公司；LWGY酒精濃度計(jì)：廣州銘睿電子科技有限公司；HH-6雙浴六孔恒溫水浴鍋：上海喬躍電子有限公司；CPA6202S電子天平：德國塞多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚果醋加工工藝流程[9]

1.3.2 酒精發(fā)酵試驗(yàn)

在酒精發(fā)酵基本培養(yǎng)基中加入酵母菌，參照文獻(xiàn)[10-11]，研究酵母接種量（5%、10%、15%、20%、25%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、糖度（8%、10%、12%、14%、16%）對(duì)酒精發(fā)酵的影響。并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 桑葚果醋酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

1.3.3 醋酸發(fā)酵試驗(yàn)

將活化的醋酸菌A35接入醋酸菌液體種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d，得到醋酸菌種子液，分別研究初始酒精度（2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol）、醋酸菌接種量（4%、8%、12%、16%、20%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）3個(gè)因素對(duì)桑葚果醋發(fā)酵的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定以下正交因素與水平，見表2。

表2 桑葚果醋醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

1.3.4 測(cè)定方法

酒精度測(cè)定[12]：蒸餾法；糖度測(cè)定：糖度計(jì)法[12]；產(chǎn)酸量（以醋酸計(jì)）測(cè)定[13]：酸堿滴定法。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚果汁酒精發(fā)酵試驗(yàn)

2.1.1 酵母接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響

在酒精發(fā)酵基本培養(yǎng)基中加入蔗糖調(diào)節(jié)糖度至10%，分別接種5%、10%、15%、20%、25%的酵母液，每個(gè)接種量設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4 d后取樣測(cè)定酒精度，結(jié)果見表3。

表3 酵母菌接種量對(duì)酒精度的影響Table 3 Effect of yeast inoculum on alcohol content

由表3可知，酒精度隨著酵母接種量的增加呈增長趨勢(shì)，當(dāng)酵母接種量為15%時(shí)酒精度最高，為6.1%vol。隨著接種量的進(jìn)一步增加，酒精度反而降低，因此，過高的酵母接種量可能會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基營養(yǎng)的大量消耗而影響酒精發(fā)酵。因此，酵母接種量15%為宜。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響

在酒精發(fā)酵基本培養(yǎng)基中加入蔗糖調(diào)節(jié)糖度至10%，接種15%的酵母液，分別置于26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，培養(yǎng)4 d后取樣測(cè)定酒精度，結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響Table 4 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由表4可知，溫度達(dá)30 ℃時(shí)酒精度最高，為5.8%vol，因此，溫度為30 ℃桑葚果汁酒精發(fā)酵最佳。

2.1.3 糖度對(duì)桑葚果汁酒精發(fā)酵的影響

在酒精發(fā)酵基本培養(yǎng)基中接入15%的酵母液，用蔗糖分別調(diào)整糖度為8%、10%、12%、14%、16%，每個(gè)糖度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，培養(yǎng)4 d后取樣測(cè)定酒精度，結(jié)果見表5。

表5 糖度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Table 5 Effect of different sugar content on alcohol content

由表5可知，酒精度隨著糖度的增加呈增長趨勢(shì)，當(dāng)糖度達(dá)到14%時(shí)酒精度最高為6.5%vol。隨著糖度的進(jìn)一步增加，酒精度反而降低，糖濃度過高反而會(huì)對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。因此，糖度14%為宜。

2.1.4 桑葚果汁酒精發(fā)酵的正交試驗(yàn)

為了確定桑葚果汁酒精發(fā)酵的最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（33）正交試驗(yàn)，考察酵母接種量、發(fā)酵溫度、糖度3個(gè)因素對(duì)酒精度的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析見表7。

由表6可知，各因素對(duì)酒精度的影響次序?yàn)锳（酵母接種量）＞C（糖度）＞B（溫度）；酒精發(fā)酵的理論最佳組合為A2B2C3，即酵母接種量15%，溫度30 ℃，糖度16%，在此條件下酒精度為6.3%vol。由表7可知，酵母接種量對(duì)試驗(yàn)有顯著影響（P＜0.05）。

表6 桑葚果醋酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

表7 桑葚果醋酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)的方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

2.2 桑葚果醋發(fā)酵試驗(yàn)

2.2.1 初始酒精度對(duì)桑葚果醋發(fā)酵的影響

在醋酸發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入95%無水乙醇用以調(diào)整酒精度至2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol和6%種子液，分別于120 r/min、30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。每隔1 d取樣測(cè)定酸度，計(jì)算產(chǎn)酸量，結(jié)果見圖1。

圖1 初始酒精度對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.1 Effect of initial alcohol concentration on acid production

從圖1可以看出，初始酒精度為4%vol～8%vol時(shí)，醋酸菌種發(fā)酵旺盛，醋酸產(chǎn)量高，在第5天達(dá)到最大值；隨著酒精含量升高，產(chǎn)酸量反而降低。由此可以確定醋酸發(fā)酵的最適酒精度為4%vol～8%vol。

2.2.2 醋酸菌接種量對(duì)桑葚果醋發(fā)酵的影響

在醋酸發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別接入4%、8%、12%、16%、20%的醋酸菌種子液，用95%vol乙醇調(diào)節(jié)酒精度至8%vol，分別于120 r/min、30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每個(gè)接種量設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。每隔1 d取樣測(cè)定酸度，計(jì)算產(chǎn)酸量，結(jié)果見圖2。

圖2 接種量對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.2 Effect of acetic acid bacteria inoculum on acid production

從圖2可以看出，接種量為16%時(shí)，產(chǎn)酸量在第5天達(dá)到最高值。

2.2.3 不同溫度對(duì)桑葚果醋發(fā)酵的影響

在醋酸發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接入16%的醋酸菌種子液，用95%vol乙醇調(diào)節(jié)酒精度至6%vol，分別放置溫度26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，120 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。每隔1 d取樣測(cè)定酸度，計(jì)算產(chǎn)酸量，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of temperature on acid production

從圖3可以看出，發(fā)酵溫度為30～34 ℃時(shí)，醋酸菌種發(fā)酵旺盛，醋酸產(chǎn)量高，在第5天達(dá)到最大值；由此可以確定發(fā)酵醪的最適溫度為30～34 ℃。

2.2.4 桑葚果醋發(fā)酵的正交試驗(yàn)

為了確定桑葚果醋發(fā)酵的最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)L9（34），考察醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、初始酒精濃度3個(gè)因素對(duì)醋酸發(fā)酵的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果見表8，方差分析結(jié)果見表9。

表8 桑葚果醋醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

表9 桑葚果醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)的方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

由表8可知，各因素對(duì)醋酸發(fā)酵的影響次序?yàn)锳（酵母菌接種量）＞B（溫度）＞C（初始酒精度），醋酸發(fā)酵的最佳組合為A3B2C3：醋酸菌接種量20%，初始酒精度8%vol，發(fā)酵溫度32 ℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，產(chǎn)酸量達(dá)為51.34 g/L。由表9可知，3個(gè)因素均對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響。

2.3 成品質(zhì)量指標(biāo)

根據(jù)以上試驗(yàn)確定的醋酸發(fā)酵的最佳組合，在醋酸發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接入20%的醋酸菌種子液，用95%vol乙醇調(diào)節(jié)酒精度至8%vol，120 r/min，32 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，5 d后，測(cè)定其產(chǎn)酸量達(dá)51.34 g/L，并觀察其感官指標(biāo)，測(cè)定其理化及微生物指標(biāo)。

2.3.1 感官指標(biāo)

色澤：紫紅色，有光澤。香氣：具有醋香和桑葚特有的果香。滋味：無不良異味，酸中微甜。體態(tài)：基本澄清，無沉淀。

2.3.2 理化指標(biāo)

可溶性無鹽固形物≥0.50 g/100 mL；酸（以醋酸計(jì)）≥3.5 g/100 mL；砷（以As 計(jì)）≤0.5 mg/kg；鉛（以Pb 計(jì)）≤1.0 mg/kg；銅（以Cu 計(jì)）≤10.0 mg/kg；氨基酸態(tài)氮（甲醛法）：0.18 g/100 mL[14]。

2.3.3 微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤100個(gè)/mL；大腸桿菌≤3 MPN/100 mL；致病菌：不得檢出[15]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用搖瓶液態(tài)發(fā)酵法，通過桑葚汁的酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵兩個(gè)階段的研究，確定了桑葚果醋發(fā)酵的最優(yōu)條件。結(jié)果表明，桑葚果汁酒精發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為溫度30 ℃、糖度16%、酵母菌接種量20%，發(fā)酵周期4 d，在此條件下酒精度為6.3%vol；桑葚果醋發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為溫度32 ℃、酒精度8%vol、醋酸接種量20%，在此條件下產(chǎn)酸量達(dá)為5.13 g/L。

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