李 霞，王道會(huì)，徐建春

（青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司，山東 青島 266400）

花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）屬于n-6系列多不飽和脂肪酸，是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等二十碳衍生物的直接前體[1]。ARA具有多種生理功能，可降低血脂，緩解胰島素抵抗，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和視網(wǎng)膜發(fā)育，尤其對(duì)于胎兒和嬰幼兒腦部發(fā)育具有重要作用[2]。ARA目前被廣泛應(yīng)用于保健品、藥品及嬰幼兒食品領(lǐng)域，其傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝主要是從動(dòng)物肝臟、豬腎上腺、蛋黃和深海魚油中直接提取[3]，產(chǎn)量低且受季節(jié)影響，無法滿足市場需求。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)ARA具有生產(chǎn)周期短，不受原料、產(chǎn)地和季節(jié)限制等明顯的優(yōu)勢(shì)，目前已成為ARA的主流生產(chǎn)模式[4]。高山被孢霉（Mortierella alpina）被認(rèn)為是最佳的ARA 生產(chǎn)菌株。該菌株具有ARA 含量高且脂肪酸組成合理等特點(diǎn)，是目前ARA生產(chǎn)方面的研究熱點(diǎn)[1]。

影響高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的因素很多，林煒鐵等[5]曾報(bào)道不同的接種方式和接種量會(huì)對(duì)被孢霉（Mortierellasp.）的菌絲形態(tài)產(chǎn)生影響，采用孢子接種且孢子濃度為4.0×105個(gè)/mL時(shí)，菌體形態(tài)為分散絲狀，可得到最大生物量和出油率。而PARK E Y等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，過大的攪拌速率和通氣量會(huì)產(chǎn)生較大的剪切力，剪切下的被孢霉菌絲消耗碳源進(jìn)行自身修復(fù)，使ARA的合成受到影響；較低直徑的小球狀菌體更利于ARA的合成。碳源和氮源是影響微生物生長的最關(guān)鍵營養(yǎng)元素。當(dāng)微生物處于營養(yǎng)充足和條件適宜的環(huán)境中，細(xì)胞內(nèi)各種代謝較為活躍且處于平衡狀態(tài)，在此階段菌體代謝以促進(jìn)細(xì)胞生長為主，而細(xì)胞中脂質(zhì)含量則維持在較低水平；當(dāng)環(huán)境條件改變時(shí)，菌體內(nèi)代謝平衡被打破，有利于某些代謝產(chǎn)物的積累[8]。當(dāng)培養(yǎng)基中氮源及磷、鋅、鎂等微量元素缺乏，但碳源充足時(shí)，微生物將停止生長進(jìn)入脂積累代謝狀態(tài)[9]。周蓬蓬等[10]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度在25 ℃時(shí)，高山被孢霉菌絲生長快速，而20 ℃培養(yǎng)可獲得最大出油率和ARA含量，最佳培養(yǎng)方式為分段控溫方法；而秦新政等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)溫度為31 ℃時(shí)可獲得最大菌絲生長速率。培養(yǎng)基pH值是影響微生物生長的另一重要環(huán)境因素，目前報(bào)道的高山被孢霉的最佳培養(yǎng)基pH值主要集中在6.0～7.0[12-13]，偏酸性環(huán)境適宜高山被孢霉的脂質(zhì)積累[14]。

本研究利用誘變育種篩選一株高山被孢霉高產(chǎn)花生四烯酸菌種，針對(duì)該菌種進(jìn)行了培養(yǎng)條件的優(yōu)化，并進(jìn)行10 L自動(dòng)發(fā)酵罐的放大驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株由青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司科海研究所自行馴化保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖2%，瓊脂1%。

種子液體培養(yǎng)基：葡萄糖35 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，MgSO40.8 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2HPO41.2 g/L，Na2SO40.4 g/L，pH 6.0～7.0，120 ℃條件下滅菌30 min。

發(fā)酵基本培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨8 g/L，MgSO41 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2HPO41.5 g/L，（NH4）2SO40.6 g/L，CaCl2·2H2O 0.5 g/L，pH 6.0～7.0，120 ℃條件下滅菌30 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

MgSO4、KH2PO4、（NH4）2HPO4、（NH4）2SO4、CaCl2·2H2O、Na2SO4等無機(jī)鹽試劑均為分析純：天津巴斯夫化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL602-L型電子天平、FE20型pH計(jì)：上海梅特勒托利多公司；DZG-6090型電熱真空干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器公司；RE52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HYL-C型組合式搖床：太倉強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HSY10L型全自動(dòng)發(fā)酵罐：無錫匯森生物設(shè)備有限公司；Trace1300型氣相色譜儀：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保存菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板，于26 ℃條件下活化培養(yǎng)5～7 d。

1.3.2 種子培養(yǎng)

從活化培養(yǎng)基刮下孢子接種于種子培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/500 mL，26 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，作為發(fā)酵種子液。

1.3.3 搖瓶培養(yǎng)

將種子液中菌體用分散機(jī)打散，以一定濃度將菌體片段接種于發(fā)酵基本培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/500 mL，26 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)5～7 d。

1.3.4 菌體干質(zhì)量的測定

將搖瓶培養(yǎng)得到的發(fā)酵液抽濾得到菌體，以蒸餾水沖洗3次，抽濾沖洗液；將得到的菌體置于45 ℃恒溫干燥箱中烘至質(zhì)量恒定。菌體干質(zhì)量計(jì)算公式如下：

1.3.5 菌體脂質(zhì)提取

將干菌體粉碎后加入正己烷，采用索氏抽提法[15]進(jìn)行脂質(zhì)提取，所得提取液在40 ℃下減壓蒸餾，獲得菌體脂質(zhì)。菌體出油率計(jì)算公式如下：

1.3.6 菌體脂質(zhì)的脂肪酸組成分析及ARA含量分析

樣品前處理及菌體脂質(zhì)脂肪酸組成采用高效氣相色譜法測定，具體操作參照國標(biāo)GB 26401—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑花生四烯酸油脂（發(fā)酵法）》中對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)ARA的定量檢測方法。ARA含量指ARA在菌體油脂的脂肪酸組成中所占比例，其計(jì)算公式如下：

1.3.7 單因素試驗(yàn)及放大試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合前人研究成果和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選定溫度、時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速、碳氮比和pH值作為單因素實(shí)驗(yàn)變量，以優(yōu)化高山被孢霉的培養(yǎng)條件。為驗(yàn)證優(yōu)化后培養(yǎng)條件的生產(chǎn)應(yīng)用效果，本實(shí)驗(yàn)采用10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體形態(tài)及發(fā)酵產(chǎn)物的影響

高山被孢霉屬于絲狀真菌，在進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)會(huì)呈現(xiàn)不同的菌體形態(tài)，主要有球狀和絲狀。球狀菌體是由菌絲緊密地纏繞組成單個(gè)獨(dú)立體，絲狀菌體則是菌絲均勻地懸浮在整個(gè)液體培養(yǎng)基中，不同的菌體形態(tài)會(huì)對(duì)出油率和ARA含量產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用菌體片段接種時(shí)，接種量對(duì)菌體形態(tài)無顯著影響，均為小球狀；而影響菌體形態(tài)的主要因素為培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。搖床轉(zhuǎn)速單因素試驗(yàn)培養(yǎng)條件為24 ℃條件下培養(yǎng)7 d，pH值為6.0，碳氮比為2.5，搖床轉(zhuǎn)速梯度設(shè)計(jì)為80 r/min、120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，結(jié)果見表1。

表1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體形態(tài)及發(fā)酵產(chǎn)物的影響Table 1 Effect of the rotate speed on mycelial morphology and fermentation results

由表1可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速較低處于80～120 r/min時(shí)，菌絲纏繞較為緊密，菌體形態(tài)為直徑較大的球狀，菌體干質(zhì)量和出油率較低。隨著轉(zhuǎn)速的增長，球狀菌體直徑逐漸減小；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時(shí)，菌體形態(tài)變?yōu)榻z狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，菌體為直徑1～2 mm小球狀，菌體干質(zhì)量、出油率和ARA含量均達(dá)到最高，分別為45.5 g/L，24.8 g/L和50.6%；而菌體為絲狀時(shí)，菌體干質(zhì)量和出油率均有所下降；得出培養(yǎng)最佳搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.2 碳氮比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

本實(shí)驗(yàn)碳氮比分別設(shè)計(jì)為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0共7個(gè)梯度，發(fā)酵周期7 d，溫度24 ℃，pH值為6.0，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，結(jié)果如圖1所示。

圖1 碳氮比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.1 Effect of C/N ratio on fermentation results

由圖1可知，在發(fā)酵完成后，當(dāng)碳氮比達(dá)到2.5時(shí)，可獲得最大菌體干質(zhì)量為49.0 g/L；而之后隨著碳氮比的持續(xù)升高，菌體干質(zhì)量開始下降，說明較低的含氮量開始降低菌體的生長速度。碳氮比達(dá)到3.0時(shí)可獲得最大出油率和ARA含量，分別為24.8 g/L和49.8%，此后隨著碳氮比的上升，總體出油率開始由于生物量的降低而下降，ARA含量則基本不變。因此，綜合出油率和ARA含量，培養(yǎng)基最佳碳氮比應(yīng)控制在3.0。

2.3 溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

圖2 溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.2 Effect of temperature on fermentation results

本實(shí)驗(yàn)采用恒溫發(fā)酵，分別設(shè)定發(fā)酵溫度為18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃，發(fā)酵周期7 d，pH值為6.0，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，碳氮比為3.0，對(duì)發(fā)酵溫度進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，培養(yǎng)溫度在28 ℃時(shí)，菌體生長迅速，可獲得最大生物量，菌體干質(zhì)量為45.6 g/L。而溫度為26 ℃時(shí)可獲得最大出油率和ARA含量分別為23.6 g/L和48.8%，因此綜合考慮最佳發(fā)酵溫度為26 ℃。

2.4 pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定pH值分別為6.0、6.2、6.5、6.8、7.0，發(fā)酵溫度26 ℃，周期7 d，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，碳氮比為3.0，考察pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.3 Effect of pH on fermentation results

由圖3可知，pH值為6.5時(shí)，可獲得最大出油率達(dá)到22.6 g/L，ARA含量為45.1%；而生物量和ARA含量均在pH值為6.2時(shí)達(dá)到最高，分別為46.7 g/L和51.1%，出油率為21.7 g/L。以ARA產(chǎn)量為主要考量指標(biāo)，綜合考慮培養(yǎng)基pH值為6.2較好。

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

按照優(yōu)化后的發(fā)酵條件對(duì)高山被孢霉進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基碳氮比3.0，pH值為6.2，發(fā)酵溫度26 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵時(shí)間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d。發(fā)酵結(jié)束后測定菌體干質(zhì)量、出油率及ARA含量，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.4 Effect of fermentation time on fermentation results

由圖4可知，菌體的快速生長期為第2～3天，同時(shí)伴隨著油脂的迅速積累；菌體干質(zhì)量在第4天可達(dá)42.7 g/L，隨后增長緩慢，出油率在第5天達(dá)到最高為21.7 g/L，隨后基本穩(wěn)定；ARA含量也在第5 天達(dá)到最高為50.6%，隨后有所下降。因此，采用優(yōu)化后發(fā)酵條件培養(yǎng)5 d即可獲得最大ARA含量。

2.6 10 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行3次放大試驗(yàn)，裝液量60%，接種量10%，消泡劑為聚氧丙烯甘油，發(fā)酵溫度26 ℃，罐壓0.05～0.08 MPa，通氣量4 000 L/h，發(fā)酵液pH值為6.2，發(fā)酵周期5 d，發(fā)酵結(jié)束后測定菌體干質(zhì)量、出油率及ARA含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 10 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)Table 2 Amplification test for 10 L fermentation cylinder

由表2可知，在優(yōu)化后培養(yǎng)條件下，5 d發(fā)酵后平均菌體干質(zhì)量為45.4 g/L，出油率為24.1 g/L，ARA含量為49.6%，菌體形狀為球狀，直徑1～2 mm。發(fā)酵產(chǎn)物及ARA產(chǎn)量與搖瓶培養(yǎng)相當(dāng)，證明采用優(yōu)化工藝擴(kuò)大培養(yǎng)的可行性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以發(fā)酵所得菌體干質(zhì)量、出油率和ARA含量為主要參考指標(biāo)，對(duì)高山被孢霉搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過對(duì)搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基碳氮比、發(fā)酵溫度、pH值等參數(shù)進(jìn)行單因素變量分析，確定本株高山被孢霉菌種的最佳培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)基碳氮比3.0，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 值為6.2，發(fā)酵時(shí)間為5 d。在保持發(fā)酵參數(shù)不變的情況下，在10 L發(fā)酵罐進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，裝液量60%，接種量10%，通氣量4 000 L/h，發(fā)酵周期縮短至5 d，所得菌體干質(zhì)量、出油率和ARA含量分別為45.4 g/L、24.1 g/L和49.6%。證明了該發(fā)酵工藝的可行性，為進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)提高生產(chǎn)效率打下基礎(chǔ)。

[1]叢蕾蕾，彭 超，紀(jì)曉俊，等.高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸及其遺傳改造的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（9）：1232-1238.

[2]楊朝霞，張 麗，李朝陽.花生四烯酸的營養(yǎng)保健功能[J].食品與藥品，2005，7（1）：69-71.

[3]BAJPAI P K,BAJPAI P,WARD O P.Production of arachidonic acid byMortierella alpinaATCC 32222[J].J Ind Microbiol,1991,8(3):179-185.

[4]PENG C,HUANG H,JIN M J,et al.Optimization of medium components for biomass and arachidonic acid production byMortierella alpinaME-1 using response surface methodology[J].Food Sci,2009,30(13):205-211.

[5]林煒鐵，朱 敏.利用被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)油脂和花生四烯酸[J].中國飼料，2008（24）：35-37.

[6]PARK E Y,KOIZUMI K,HIGASHIYAMA K.Analysis of morphological relationship between micro-and macromorphology ofMortierellaspecies using a flow-through chamber coupled with image analysis[J].J Eukaryot Microbiol,2006,53(3):199-203.

[7]PARK E Y,HAMANAKA T,HIGASHIYAMA K,et al.Monitoring of morphological development of the arachidonic-acid-producing filamentous microorganismMortierella alpina[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,59(6):706-712.

[8]RATTRAY J B M.Biotechnology and the fats and oils industry-an overview[J].J Am Oil Chem Soc,1984,61(11):1701-1712.

[9]GRANGER L M,PERLOT P,GOMA G,et al.Effect of various nutrient limitations on fatty acid production byRhodotorula glutinis[J].Appl Microbiol Biotechnol,1993,38(6):784-789.

[10]周蓬蓬，余龍江，吳元喜，等.高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸發(fā)酵條件的研究[J].工業(yè)微生物，2003，33（2）：41-45.

[11]秦新政，楊新平，陳 競，等.高山被孢霉菌絲生長條件的響應(yīng)面法優(yōu)化[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，51（1）：95-103.

[12]沈以凌，劉 洋，虞 龍.高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸條件的研究[J].食品科技，2009（2）：35-38.

[13]代 鵬，陳海琴，顧震南，等.高山被孢霉生產(chǎn)多不飽和脂肪酸發(fā)酵條件的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2014，35（5）：354-359.

[14]鄧中濤，紀(jì)曉俊，聶志奎，等.高山被孢霉三階段培養(yǎng)法生產(chǎn)花生四烯酸油脂[J].生物加工過程，2013，11（4）：8-13.

[15]張龍翔，張庭芳，李令媛，等.生化試驗(yàn)方法與技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1981.