肖連冬，王志強

（1.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473000；2.南陽市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心，河南 南陽 473000）

膽固醇是人體組織細胞不可缺少的重要物質(zhì)，它不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料，但人體內(nèi)血清膽固醇過高會引起動脈硬化和心臟病。研究表明，高膽固醇膳食與心血管疾病發(fā)病率有關(guān)系，降低膽固醇含量可相應(yīng)減少冠心病的發(fā)病率和死亡率[1-3]。因此，降低食品中的膽固醇，開發(fā)低膽固醇食品對減少動脈硬化和冠心病的發(fā)生、提高人們的生存質(zhì)量具有重要意義[4]。目前國內(nèi)外研究有兩方面：①利用物理方法、化學方法或生物方法脫除食品中的膽固醇；②開發(fā)食用后能在體內(nèi)通過某種作用減少血清膽固醇含量的食品或藥品。其中，依靠微生物作用為主的生物方法因其效率高、成本較低且能較好保留食品原有營養(yǎng)成分及風味而得到研究者的青睞[5-7]。1979年，日本學者遠騰章發(fā)現(xiàn)紅色紅曲霉（Monascus）能產(chǎn)生強降膽固醇物質(zhì)莫納可林（Monacolin）K，微生物學家們也對它的藥用生理價值進行了研究探討[8]。我國對降膽固醇紅曲霉的研究相對落后，一是缺乏優(yōu)良的紅曲霉菌株，二是培養(yǎng)工藝欠佳。因此進行紅曲霉菌株的分離篩選和研究應(yīng)用具有非常重要的現(xiàn)實意義。本研究以紅方豆腐乳為菌源材料，通過平板分離、形態(tài)特征和降膽固醇試驗，篩選出能夠有效降解膽固醇的紅曲霉菌株，為其在食品加工行業(yè)中的應(yīng)用及有效降解膽固醇的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

紅方豆腐乳：市售；大麥芽：南陽天冠啤酒有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：取粉碎的麥芽粉加入4倍質(zhì)量的水調(diào)漿，在恒溫水浴鍋中65 ℃糖化3 h，煮沸后兩層紗布過濾，乳酸調(diào)pH至4.5～5.5，于121 ℃滅菌20 min。

富集培養(yǎng)基：在麥芽汁培養(yǎng)基中加入適量乙醇和鏈霉素。

分離培養(yǎng)基：用麥芽汁培養(yǎng)基。7～8°Bé麥芽汁，可溶性淀粉2%，蛋白胨0.5%，瓊脂2%，121 ℃滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：在麥芽汁培養(yǎng)基中加入經(jīng)干燥研碎的蛋黃（6 g/1 000 mL）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，谷氨酸單鈉鹽（或組氨酸）5 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，CaCl20.1 g，K2HPO45 g，KH2PO45 g，MnSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，酵母膏10 g，pH 5.0，加入膽固醇（0.3 mg/mL）用水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

膽固醇（純度99.5%）：普博欣生物科技有限責任公司；石油醚、無水乙醇、甲醇、氫氧化鉀、冰醋酸、濃硫酸、磷酸、硫酸鐵銨等均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31RTSF奧林帕斯生物顯微鏡：Philippines公司；HZQ-Q振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；PYX-PHS-50隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、HHS21-4型電熱恒溫水浴鍋：上海躍進醫(yī)療器械廠；BS110S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-1CU雙人單面水平凈化工作臺：上海博迅實業(yè)有限公司；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；721可見光分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TDL-4013臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉菌株分離

富集培養(yǎng)：取適量紅方豆腐乳汁加入麥芽汁培養(yǎng)基中，同時加入適量體積分數(shù)為95%的乙醇和鏈霉素，30～32 ℃培養(yǎng)一定時間后轉(zhuǎn)入相同培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，反復2～3次。

分離與純化：采用麥芽汁固體培養(yǎng)基稀釋平板分離，30～32 ℃培養(yǎng)4 d，形成單菌落。根據(jù)菌落形態(tài)，挑取平板上長出的單菌落反復進行純化，直至無雜菌出現(xiàn)為止。紅曲霉的形態(tài)特征為菌絲體初期無色，漸變?yōu)榧t色至紫紅色，菌絲體大量分枝，分枝的頂端產(chǎn)生單個或成串的分生孢子，孢子呈球形或橢圓形，閉囊殼橙紅色，近球形，含有多數(shù)子囊，子囊內(nèi)含8個孢子，子囊孢子呈卵形或近球形，光滑、透明、無色或漆紅色，挑取符合紅曲霉形態(tài)特征的菌種分離純化[9-11]。

1.3.2 降膽固醇菌株的初步篩選

將分離菌株接種于麥芽汁培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)4 d作為種子，以5%接種量分別接入初篩培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)一定時間，加入0.2 mL的鐵礬顯色劑顯色，并與未接種培養(yǎng)基比較，根據(jù)顏色的深淺判斷其能否降膽固醇及其降解效果，初步選出降膽固醇菌株。

1.3.3 膽固醇降解試驗

將初篩得到的能降解膽固醇的菌株進行膽固醇降解試驗，采用與初篩相同的培養(yǎng)方法進行發(fā)酵降解，用直接皂化-比色法定量測定菌株降膽固醇能力，以確定不同發(fā)酵方式、不同發(fā)酵時間對膽固醇降解率的影響。

1.3.4 膽固醇測定方法

膽固醇降解定性分析采用鐵礬顯色劑顯色法[12]：取2 mL菌株初篩培養(yǎng)液于試管中，加入0.2 mL的鐵礬顯色劑顯色，各管與未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基相比，根據(jù)顏色的深淺判斷其降解效果，初步篩選出高效菌株。

膽固醇降解定量分析采用皂化比色法[13-15]：取5 mL培養(yǎng)液，加入5 mL KOH-甲醇溶液（200 g/L）振蕩混合均勻后，放入80 ℃水浴中，皂化30 min，并不停振蕩，將皂化混合物冷卻至20 ℃，加入10 mL石油醚振蕩萃取數(shù)分鐘，靜置，分層后將上層液移入10 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL于試管中，在85 ℃水浴下?lián)]發(fā)干溶劑，然后向試管中加入3 mL冰乙酸溶解殘余物，再加3 mL鐵礬顯色劑，在60 ℃水浴中顯色15 min，用分光光度計于波長490 nm處測其吸光度值（OD）。

1.3.5 膽固醇標準曲線的繪制

準確稱取硫酸鐵氨4.463 0 g，用85%的磷酸定容至100 mL，配制成鐵礬顯色劑儲備液，吸取20 mL儲備液，用硫酸定容至250 mL，配制成鐵礬顯色劑工作液。

準確稱取膽固醇標準品100 mg，溶于石油醚中，并定容至50 mL，配制質(zhì)量濃度為2 g/L的膽固醇儲備液。吸取膽固醇標準儲備液5 mL，并用石油醚定容至50 mL，配制質(zhì)量濃度為0.2 g/L的膽固醇工作液。

膽固醇標準曲線的制作：準確吸取膽固醇工作液0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL分別置于8支試管中，置于85 ℃水浴中揮發(fā)干溶劑，在各管中加入冰乙酸5 mL，沿管壁加3 mL鐵礬顯色液，混勻，60 ℃水浴中顯色15 min，在波長490 nm處測定吸光度值。根據(jù)標準曲線方程求出膽固醇的含量，計算出降解率，其計算公式如下：

式中：C0為原始培養(yǎng)基中膽固醇的含量；mg/mL；C1為培養(yǎng)后培養(yǎng)基中膽固醇含量，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽固醇標準曲線的建立

以膽固醇質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制膽固醇標準曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 膽固醇標準曲線Fig.1 Standard curve of cholesterol

由圖1可知，標準曲線方程為y=9.983 8x-0.000 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，表明二者線性關(guān)系良好。

2.2 紅曲霉菌株的分離純化及形態(tài)觀察

通過分離得到兩株紅曲霉菌株X1和X2。兩株紅曲霉在麥芽汁瓊脂上的生長良好，菌落初為白色，后變?yōu)榈凵?、紫紅色，其菌落形態(tài)特征見表1。

表1 紅曲霉菌株的菌落形態(tài)特征Table 1 Morphological features of Monascus colony

在顯微鏡下觀察其個體形態(tài)可見，兩株菌的菌絲均無橫隔，多核，有分枝。隨著培養(yǎng)時間延長，菌絲壁增厚，菌絲增粗，并由菌絲形成分生孢子。分生孢子著生在菌絲及其分枝的頂端，單生或成串生長，呈糖葫蘆狀。閉囊殼呈球形，有長短不一的柄。紅曲霉菌絲、閉囊殼、分生孢子等顯微觀察結(jié)果分別見圖2～圖3。

圖2 紅曲霉菌株X1(a)和X2(b)菌絲形態(tài)Fig.2 The hypha morphology of X1(a) and X2(b)

圖3 紅曲霉X1(a)和X2(b)分生孢子形態(tài)Fig.3 The conidiospore morphology of X1(a) and X2(b)

將兩菌株分別接種到含乙醇的麥芽汁試管中進行培養(yǎng)，長出的菌產(chǎn)紅色色素、菌絲成團，符合紅曲霉的生態(tài)習性。

通過分離菌株X1、X2菌落形態(tài)特征與顯微形態(tài)特征與紅曲霉（Monascus）的屬征[16]相比較，兩者相吻合，再結(jié)合鄭虹[17]對紅曲霉的有關(guān)描述，可以證實分離的X1、X2菌株為紅曲霉屬真菌。

2.3 降膽固醇菌株的初篩

對所分離出的兩株紅曲霉在含蛋黃6 g/1 000 mL的初篩培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，通過鐵礬顯色劑顯色觀察顏色變化情況。因為膽固醇的濃度和顯色顏色深淺有關(guān)，膽固醇濃度越高，顯色后顏色越深，從而判斷其是否降膽固醇的能力。在32 ℃下，分別靜置培養(yǎng)3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，并與剛接種的培養(yǎng)基進行比較，兩菌株降膽固醇情況結(jié)果見表2。

表2 降膽固醇菌株的初篩結(jié)果Table 2 Primary screening results of cholesterol-reducing strains

從表2可見，X2菌株隨著培養(yǎng)時間的增加，顏色明顯變淺，說明膽固醇降解能力強。X1菌株培養(yǎng)4 d時顏色略有變淺，但隨著時間的延長顏色略有增加，這可能是X1菌株大量產(chǎn)生紫紅色色素增加了培養(yǎng)液的顏色，它降膽固醇能力較弱。

2.4 不同發(fā)酵方式對X2菌株降膽固醇的影響

將兩組裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶，分別接入3 mL種子液，其中一組三角瓶在32 ℃靜態(tài)培養(yǎng)6 d，另一組在32 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)6 d，通過皂化比色法測定其膽固醇含量，計算出膽固醇降解率，其結(jié)果見表3。

表3 不同發(fā)酵方式對膽固醇降解率的影響Table 3 Effect of different fermentation modes on degradation rate of cholesterols

由表3可知，在相同的發(fā)酵時間里，搖床發(fā)酵的發(fā)酵液中的膽固醇濃度較低，說明紅曲霉在氧氣充足情況下，降解膽固醇能力強，所以搖床培養(yǎng)有利于膽固醇的降解。

2.5 發(fā)酵時間對X2菌株膽固醇降解率的影響

在100 mL三角瓶中裝入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種3 mL種子液后于32 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，考察發(fā)酵時間對膽固醇降解率的影響。紅曲霉X2菌株降解膽固醇隨時間的變化情況見表4。

從表4可見，在發(fā)酵的前4 d，隨著發(fā)酵時間的增加，X2菌株對膽固醇降解率快速增加，其后降解率增加緩慢，在發(fā)酵至第6天時降解率高達60.82%，其后膽固醇含量無明顯變化。另外，從膽固醇降解與紅曲霉色素產(chǎn)生情況可知，紅色素的產(chǎn)生與膽固醇的降解沒有相關(guān)性，紅色素的產(chǎn)生量也是隨著該菌株培養(yǎng)時間的延長而增加。

表4 發(fā)酵時間對X2菌株膽固醇降解率的影響Table 4 Effect of fermentation time on degradation rate of cholesterols by strain X2

3 結(jié)論

本試驗采用紅方豆腐乳為菌源材料，分離純化得到兩株紅曲霉菌株X1和X2。對菌株的生長及形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進行了觀察，兩株紅曲霉在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落初為白色，后變?yōu)榈凵?，最后變?yōu)榧t色和紫紅色，菌落多褶皺，具有輻射紋。顯微鏡觀察，兩株菌菌絲均無橫隔膜，隨培養(yǎng)時間延長，菌絲壁加厚、變粗，并由菌絲形成分生孢子，孢子單生或成串生長，呈糖葫蘆狀，閉囊殼呈球形，有長短不一的柄。用含膽固醇麥汁培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過鐵礬顯色劑顯色初步確定，紅曲霉菌株X2有顯著的膽固醇降解能力，而菌株X1則不明顯。不同發(fā)酵方式試驗表明，搖床培養(yǎng)有利于降解膽固醇。用發(fā)酵培養(yǎng)基對X2菌株進行降膽固醇試驗可知，在100 mL三角瓶中裝入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種3 mL種子液，32 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)6 d，膽固醇降解率可達60.82%。本試驗篩選得到的紅曲霉菌株X2具有較強的膽固醇降解能力，為其在食品領(lǐng)域有效利用提供了理論依據(jù)。

[1]殷軍帥，梁秋麗，方佳茂，等.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K 的工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（9）：79-84.

[2]倉義超.紅曲霉的分離篩選[J].中國釀造，2013，36（6）：119-121.

[3]李雪梅，沈興海，段震文，等.紅曲霉代謝產(chǎn)物的研究進展[J].中草藥，2011，42（5）：1018-1025.

[4]盧生有，劉秀梅，馬洪菲，等.豆瓣醬發(fā)酵種曲紅曲霉LLMY-18 的篩選分離[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（3）：88-90.

[5]李婷婷，張 洋，林 超，等.降膽固醇優(yōu)良菌株的篩選及其膽鹽水解酶特性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（4）：191-194.

[6]魏賽金，龐會忠，程 新，等.靈芝低聚果糖乳酸菌營養(yǎng)液降解膽固醇的研究[J].中國釀造，2007（5）：45-48.

[7]張 茜，王昌祿，蒿 露，等.紅曲霉對膽固醇降解特性的研究[J].中國釀造，2011，21（6）：31-34.

[8]胡文效，魏彥鋒，蔣錫龍，等.高產(chǎn)Monacolin K 紅曲霉菌種的誘變選育及液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2013，34（24）：296-301.

[9]周德慶.微生物學教程第三版[M].北京：高等教育出版社，2011.

[10]艾育芳，潘大仁，周以飛，等.環(huán)境中膽固醇降解菌的分離與鑒定[J].中國農(nóng)學通報，2011，27（18）：139-142.

[11]黃翠姬，吳 蘭，盧 莉，等.廣西紅曲米中產(chǎn)Monacolin K 紅曲霉的分離及鑒定[J].中國調(diào)味品，2014，39（5）：36-40.

[12]俞 斐，張根元.比色法測定幾種常見藥用食品中的膽固醇含量[J].安徽醫(yī)藥，2004，8（3）：217-220.

[13]丁卓平，王明華，劉振華，等.食品中膽固醇含量測定方法的研究與比較[J].食品科學，2004，25（11）：130-135.

[14]何春玫.直接皂化-比色法測定雞蛋黃中膽固醇含量[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2011（9）：110-112.

[15]朱林韜，彭展彬，曾藝濤.降低蠶蛹油中膽固醇的方法研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（13）：219-221.

[16]李鐘慶，郭 芳.紅曲霉的形態(tài)學與分類學[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2003.

[17]鄭 虹.高產(chǎn)紅曲色素紅曲霉菌株的篩選及抑菌試驗的研究[J].中國釀造，2013，32（2）：70-72.