馬 騰，趙亞琪，路福平，蔡 韜*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300222；2.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

MsiR蛋白來(lái)源于中慢生型天山根瘤菌（Mesorhizobium tianshanense）[1]，是LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控（LysR-type of transcriptional regulators，LTTRs）家族的一員。豆科植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)在根際分泌一種抗代謝物刀豆氨酸，MsiR能夠特異性的識(shí)別胞內(nèi)的刀豆氨酸，啟動(dòng)msiA基因的表達(dá)進(jìn)而將胞內(nèi)的刀豆氨酸分泌到胞外，使天山根瘤菌在豆科植物的根際成為優(yōu)勢(shì)菌，是共生結(jié)瘤的基礎(chǔ)[2]。LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白[3]是目前已知的最大的一類原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，種類繁多，來(lái)源廣泛、高度保守[4]，參與細(xì)胞分裂、生物代謝[5]、群體感應(yīng)、固氮[6]、毒素[7]產(chǎn)生等多種生命活動(dòng)，具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。

目前，轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白應(yīng)用主要有兩個(gè)方向。其一是利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白對(duì)底物識(shí)別的特異性進(jìn)行生物檢測(cè)[8]。如SHIN H J等[9]利用萘降解轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（NahR）對(duì)水楊酸的特異性識(shí)別，構(gòu)建了水楊酸的生物檢測(cè)器。其二是用于構(gòu)建動(dòng)態(tài)精確地調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。徐鵬等[10]利用丙二酸單酰輔酶A（malonyl-CoA）轉(zhuǎn)錄抑制蛋白（fapR）對(duì)細(xì)胞內(nèi)丙二酸單酰輔酶A的專一性結(jié)合，開發(fā)了控制脂肪酸合成的生物開關(guān)。通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控丙二酸單酰輔酶A的含量?jī)?yōu)化脂肪酸的合成，同時(shí)解除了過(guò)量前體化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。故而，外源蛋白在表達(dá)宿主系統(tǒng)中可溶性蛋白的含量能否達(dá)到一定水平是影響其應(yīng)用的重要因素[11]。

本研究以MsiR蛋白作為研究對(duì)象，利用mCherry熒光蛋白的單體分子具有高可溶性和高光穩(wěn)定性的特點(diǎn)[12]，構(gòu)建了MsiR-mCherry融合蛋白，建立了一種能夠簡(jiǎn)單、直觀的檢測(cè)MsiR蛋白在大腸桿菌（Escherichia coli）中的可溶性表達(dá)量的方法；并通過(guò)易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)（errorprone polymerase chain reaction，Errorprone-PCR）[13]和致突變菌株XL1-Red兩種方式構(gòu)建了msiR-mCherry基因突變文庫(kù)，經(jīng)篩選得到了4株在大腸桿菌（Escherichia coli）中以37 ℃作為誘導(dǎo)溫度下可溶性明顯提高的蛋白突變體。本研究旨在為L(zhǎng)ysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的應(yīng)用研究提供新的思路，建立一套在大腸桿菌中篩選具有高可溶性的蛋白突變體的可行方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

致突變菌株E.coliXL1-Red感受態(tài)細(xì)胞：安捷倫科技有限公司；E.coliBL21（DE3）、Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞：北京全式金生物技術(shù)有限公司；中慢生型天山根瘤菌（Mesorhizobium tianshanense）：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)朱軍教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒pET28a用于突變文庫(kù)的表達(dá)載體、質(zhì)粒pJZ369用于mCherry基因的PCR模板：本實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶NcoI、BamHI、EcoRI、MluI和HindIII：美國(guó)Fermentas公司；T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）set：美國(guó)Thermo scientific公司；Fastpfu fly高保真DNA聚合酶：北京全式金公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素：北京索萊寶科技有限公司；PCR純化試劑盒及膠回收試劑盒：美國(guó)Axygen公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒：北京康為世紀(jì)科技生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Evolution RC冷凍大容量離心機(jī)：美國(guó)Thermo Scientific公司；Master cycler pro梯度PCR儀：德國(guó)Eppendorf公司；AKTApurifier100蛋白純化儀：美國(guó)GE公司；Spectra-Max M5連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)MD公司；JN-10高壓勻質(zhì)機(jī)：廣州聚能生物科技有限公司；THZ-052小型恒溫?fù)u床：上海博彩生物科技有限公司；Scientz-IID超聲波細(xì)胞破碎儀：上海喬躍電子有限公司；JY6000C三恒多用電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Smartgel凝膠成像系統(tǒng)：北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；小型垂直電泳槽：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物序列

本實(shí)驗(yàn)所用引物序列如表1所示。

1.3.2 MsiR及MsiR-mCherry原核表達(dá)載體的構(gòu)建

（1）MsiR原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以M.tianshanense基因組DNA為模板，msiR-his-Blunt和msiR-his-EcoRI作為引物，進(jìn)行msiR-his基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR回收試劑盒回收后采用EcoRI 酶切。酶切產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳，膠回收914 bp的片段。pET28a載體采用NcoI單酶切，乙醇沉淀回收后，采用T4 DNA聚合酶進(jìn)行補(bǔ)平。經(jīng)酚氯仿抽提后，再采用EcoRI進(jìn)行酶切，膠回收5 265 bp的片段。將PCR產(chǎn)物酶切片段與載體采用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，挑取陽(yáng)性克隆至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌液送往蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司進(jìn)行測(cè)序，將此重組質(zhì)粒命名為pTM-2。

（2）MsiR-mCherry原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以M.tianshanense基因組DNA為模板，msiR-his-Blunt和msiR-mCherry-linker-2作為引物，進(jìn)行msiR基因的擴(kuò)增。以質(zhì)粒pJZ369為模板，msiR-mCherry-linker-1和mCherryhis-BamHI作為引物，進(jìn)行mCherry基因的擴(kuò)增。膠回收PCR產(chǎn)物并定量，按物質(zhì)的量1∶1的比例進(jìn)行混合，msiR-his-Blunt和mCherry-his-BamHI作為引物，采用Fastpfu fly高保真DNA聚合酶進(jìn)行msiR-mCherry基因的擴(kuò)增，將msiRmCherry基因克隆至pET28a載體并將此重組質(zhì)粒命名為pTM-RM。

1.3.3 MsiR及MsiR-mCherry的表達(dá)、純化及可溶性分析

將重組質(zhì)粒pTM-2和pTM-RM轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），選取16 ℃和37 ℃作為誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。測(cè)定mCherry熒光值及光密度值OD600nm。收集菌體，重懸于Tris Buffer[20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0；300 mmol/L NaCl；200 mmol/L KCl；10%甘油；1 mmol/L二硫代蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）]中。采用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心1 h，取上清用NI-agrose親和層析柱進(jìn)行純化，以50 mL含有50 mmol/L 咪唑的Tris Buffer清洗層析柱去除雜質(zhì)蛋白，最后以5 mL含有500 mmol/L咪唑的Tris Buffer洗脫目的蛋白并收集。取沉淀以Tris Buffer重懸至上清相同的體積。

分別取上清、沉淀、全細(xì)胞樣品加入6倍十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）LoadingBuffer，煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min后取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。

1.3.4 MsiR-mCherry突變文庫(kù)的建立及篩選

（1）采用XL1-Red感受態(tài)細(xì)胞建立突變文庫(kù)

抽提pTM-RM質(zhì)粒，按照XL1-red感受態(tài)細(xì)胞操作手冊(cè)進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，涂布于含有卡那霉素的固體LB抗性平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取200個(gè)單菌落接種至20 mL含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h。吸取5 μL轉(zhuǎn)接至10 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)3次。抽提質(zhì)粒，以25 μL 洗脫液（Elution Buffer，EB）洗脫電轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)，涂布含有卡那霉素的固體LB抗性平板收集菌體。

（2）易錯(cuò)PCR建立突變文庫(kù)

以質(zhì)粒pTM-RM為模板，RM-Error-1和RM-Error-2作為引物，采用TaqDNA聚合酶進(jìn)行易錯(cuò)PCR。反應(yīng)總體系1mL；TaqDNA聚合酶（5U/μL）10μL；Tris-HCl（100mmol/L，pH 8.3）100 μL；KCl（2 mol/L）25 μL；MgCl2（200 mmol/L）35 μL；脫氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate，dCTP）（25 mmol/L）40 μL；脫氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate，dTTP）（25 mmol/L）40 μL；脫氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate，dATP）（5 mmol/L）40 μL；脫氧鳥苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate，dGTP）（5 mmol/L）40 μL；上下游引物（100 μmol/L）各20 μL；DNA模板100 μL（終質(zhì)量濃度為20 pg/μL）；MnCl2（25 mmol/L）20 μL；ddH2O 510 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，10個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR回收試劑盒回收后克隆至pET28a載體，涂布含有卡那霉素的固體LB抗性平板收集菌體。

取突變文庫(kù)于37 ℃活化1 h，涂布于終濃度0.05 mmol/L的IPTG的固體LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落顏色，挑取紅色單菌落。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsiR及MsiR-mCherry原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

PCR擴(kuò)增得到正確的msiR和msiR-mCherry片段結(jié)果見圖1a及圖1b，在987 bp、1 659 bp處有特異性條帶出現(xiàn)。重組質(zhì)粒經(jīng)MluI和HindIII雙酶切鑒定，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1c和圖1d。由圖1c和圖1d可知，pTM2質(zhì)粒在1 760 bp和4 419 bp、pTM-RM質(zhì)粒在2 440 bp和4 419 bp處分別有特異性條帶出現(xiàn)，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切產(chǎn)生的片段大小與預(yù)期相符。重組質(zhì)粒經(jīng)金唯智科技有限公司測(cè)序，證實(shí)得到目的基因的全長(zhǎng)、無(wú)突變的陽(yáng)性克隆。

圖1 msiR 及msiR-mCherry 基因擴(kuò)增及重組表達(dá)載體酶切驗(yàn)證Fig.1 PCR product and enzyme digestion verification with recombinant vector of msiR and msiR-mCherry

2.2 MsiR及MsiR-mCherry重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

MsiR及MsiR-mCherry均能夠在E.coliBL21（DE3）中大量表達(dá)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，MsiR蛋白的分子質(zhì)量為33 ku，MsiR-mCherry蛋白的分子質(zhì)量為65 ku。采用16 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)，MsiR可溶性表達(dá)的蛋白量約占MsiR總蛋白的1/2；采用37 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)，MsiR絕大部分存在于高壓勻漿破碎菌體后的沉淀當(dāng)中，上清中只檢測(cè)到微量的MsiR蛋白，表明MsiR在此誘導(dǎo)溫度下主要是以包涵體形式存在的。MsiR-mCherry蛋白的表達(dá)形式與MsiR一致。

圖2 MsiR-mCherry蛋白(a)及MsiR(b)在不同誘導(dǎo)溫度下可溶蛋白的含量Fig.2 Concentration of MsiR-mCherry (a) and MsiR (b) soluble protein at different temperature

2.3 msiR-mCherry突變文庫(kù)篩選的可行性分析

將pET28a、pTM-2、pTM-RM 轉(zhuǎn) 化 至E.coliBL21（DE3），重組菌采用IPTG作為誘導(dǎo)劑，測(cè)定16 ℃和37 ℃時(shí)的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖3。由圖3可知，含有pET28a、pTM-2的E.coliBL21（DE3）的重組菌在16 ℃和37 ℃誘導(dǎo)下未能檢測(cè)到熒光信號(hào)；含有pTM-RM的E.coliBL21（DE3）的重組菌在16 ℃能夠檢測(cè)到明顯的mCherry熒光信號(hào)且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在37 ℃的mCherry熒光強(qiáng)度。因此，通過(guò)測(cè)定菌體的熒光強(qiáng)度能夠定性、定量的測(cè)定MsiRmCherry重組蛋白的可溶性表達(dá)量。

圖3 16 ℃(a)及37 ℃(b)溫度條件下MsiR-蛋白及MsiR-mCherry蛋白表達(dá)重組菌的熒光強(qiáng)度Fig.3 mCherry fluorescence intensity of MsiR-mCherry and MsiR recombinant expression strains with 16 ℃(a)and 37 ℃(b)

2.4 msiR-mCherry突變文庫(kù)的質(zhì)量分析

將兩種構(gòu)建方式的文庫(kù)各挑取20個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)序，以EP-PCR方式構(gòu)建的突變文庫(kù)的突變頻率約為2～4個(gè)/kb，以XL1-Red方式構(gòu)建的突變文庫(kù)的突變頻率約為1～5個(gè)/kb。而EP-PCR文庫(kù)及XL1-Red文庫(kù)突變分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4。由圖4可知，發(fā)生于C/G的突變占64.7%（33/51），而發(fā)生于A/T的突變只占35.3%（18/51），并且發(fā)現(xiàn)一個(gè)移碼突變。而發(fā)生于A/T的突變占79.3%（50/63），而發(fā)生于G/C的突變只占20.7%（13/63）未發(fā)現(xiàn)移碼突變。兩種突變文庫(kù)的構(gòu)建方式基本能夠覆蓋到所有的突變類型。

2.5 MsiR-mCherry突變株的基因序列比對(duì)及突變位點(diǎn)分析

取突變文庫(kù)于37 ℃活化1 h，涂布于含有卡那霉素和IPTG（0.05 mmol/L）的固體LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落顏色，挑取紅色單菌落。

經(jīng)過(guò)平板篩選，估算陽(yáng)性菌落所占比例約為0.3‰。目前，已得到4株在大腸桿菌中以37 ℃作為誘導(dǎo)溫度下可溶性明顯提高的蛋白突變體。采用37 ℃作為誘導(dǎo)溫度，突變株進(jìn)行蛋白表達(dá)，測(cè)定突變株的熒光強(qiáng)度，而后進(jìn)行蛋白電泳，結(jié)果見圖5。由圖5a可知，篩選得到的4株蛋白突變體的重組表達(dá)菌株在37 ℃的熒光強(qiáng)度相比于野生型蛋白重組表達(dá)菌株的熒光強(qiáng)度有了大幅的提升，且由圖5b可知，4株蛋白突變體在37 ℃作為誘導(dǎo)溫度時(shí)可溶性表達(dá)量相比于野生型蛋白有了顯著的提高，約占重組蛋白總量的1/2。

圖5 37 ℃下不同突變株的熒光強(qiáng)度(a)及可溶性蛋白表達(dá)量(b)Fig.5 mCherry fluorescence intensity (a) and soluble expression (b) of different mutations at 37 ℃

突變基因的突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸變化情況見表2。由表2可知，目前得到了4株影響MsiR可溶性的突變體。通過(guò)MsiR蛋白與LysR家族蛋白的同源建模分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸突變大多發(fā)生在MsiR的N端（如A23P、I47V等），這部分區(qū)域通常以螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋[14]的形式存在，是MsiR與DNA的作用區(qū)域。通過(guò)篩選結(jié)果推測(cè)MsiR的N端是影響蛋白可溶性的關(guān)鍵區(qū)域。除此之外，某些突變發(fā)生在MsiR N端和C端之間的linker區(qū)域（如L78N、M68L），影響蛋白的寡聚化形態(tài)[15]，寡聚化形態(tài)的改變會(huì)影響蛋白的聚集狀態(tài)進(jìn)而改變其在胞內(nèi)環(huán)境的溶解性。另外一部分處于MsiR的蛋白骨架結(jié)構(gòu)[16]上（如S122D、A172D），這部分突變可能會(huì)影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其空間折疊、構(gòu)象等發(fā)生改變，進(jìn)而帶來(lái)可溶性的變化。

表2 突變情況匯總Table 2 Mutations conditions of MsiR

3 結(jié)論

mCherry熒光蛋白的可溶性高，光穩(wěn)定性強(qiáng)，使用mCherry與外源蛋白形成融合蛋白時(shí)，mCherry熒光蛋白的活性與被融合的外源蛋白的功能沒(méi)有明顯的影響。本研究以天山根瘤菌中的MsiR蛋白作為研究對(duì)象，驗(yàn)證了通過(guò)檢測(cè)MsiR-mCherry融合蛋白的熒光信號(hào)來(lái)簡(jiǎn)單、直觀、定量的檢測(cè)MsiR蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量的可行性。采用易錯(cuò)PCR和致突變菌株兩種方式構(gòu)建突變文庫(kù)，經(jīng)篩選得到了4株在大腸桿菌中以37 ℃作為誘導(dǎo)溫度下可溶性明顯提高的蛋白突變體。此種方法能夠?qū)崿F(xiàn)高通量水平的篩選，誤差小，能廣泛地應(yīng)用到各種胞內(nèi)蛋白高可溶性突變株的篩選。

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