吳蘇生，白 亮，鄭祖亮，張玲玲，劉 晴，趙 輝，杜 剛*

（天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

低溫發(fā)酵（10～15 ℃）可以減少高級(jí)醇含量以及增加萜烯類和乙酸酯類香氣物質(zhì)[1-2]，從而提高葡萄酒的風(fēng)味[3-4]，因此低溫發(fā)酵技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于葡萄酒的生產(chǎn)中。例如，白葡萄酒和桃紅葡萄酒的發(fā)酵溫度為10～15 ℃，冰酒和起泡葡萄酒的瓶?jī)?nèi)二次發(fā)酵溫度為8 ℃左右。然而釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的最適發(fā)酵溫度為25～28 ℃，低溫發(fā)酵不僅降低酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，延長(zhǎng)潛伏期至一周以上，而且降低發(fā)酵速率，使發(fā)酵周期延長(zhǎng)至兩周以上，給葡萄酒產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失[5]。因此，選育具有優(yōu)良發(fā)酵性能的低溫釀酒酵母對(duì)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

為了保持葡萄酒酵母代謝研究中發(fā)酵培養(yǎng)基成分的一致性，模擬合成葡萄汁培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)室的研究中[6]。在實(shí)際操作中，活性干酵母的活化溫度為40 ℃左右，而發(fā)酵溫度為10～15 ℃，若直接把活化好的酵母接種到發(fā)酵罐內(nèi)，會(huì)對(duì)酵母的存活率和發(fā)酵的啟動(dòng)產(chǎn)生不良影響，使發(fā)酵啟動(dòng)點(diǎn)推遲。為了使酵母適應(yīng)這種低溫的發(fā)酵環(huán)境，實(shí)際操作中，先將活化好的酵母與葡萄汁混合，再控制溫度逐漸下降至發(fā)酵溫度，目的是使釀酒酵母適應(yīng)低溫的發(fā)酵環(huán)境后再啟動(dòng)發(fā)酵。但此低溫鍛煉操作缺乏科學(xué)性解釋并且相關(guān)的低溫鍛煉的研究較少且不夠深入，因此，該文開展與低溫鍛煉相關(guān)的研究，不僅可以用于解釋上述干酵母活化實(shí)際操作的科學(xué)性，而且對(duì)低溫鍛煉的研究?jī)?nèi)容提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霞多麗葡萄：采摘于北京郊區(qū)的葡萄園。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BH8：從中科院植物所選育的釀酒品種“北紅”中篩選得到并由中科院微生物研究所鑒定[7]。

硫代硫酸鈉、硫酸銨、酒石酸、亞甲基藍(lán)、檸檬酸鈉、濃硫酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀、無水乙醇等均為分析純：北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏：淮坊盛泰藥業(yè)有限公司；二烷酸二甲酯（dimethyl dicarbonate）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，hepes）緩沖液、磷酸二羥基丙酮（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、乙二胺四乙酸（ethlenediaminetetra acetic acid，EDTA）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）：美國(guó)Sigma公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母膏2.0%，蛋白胨2.0%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min[8]。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀、Waters2414示差檢測(cè)器、Aminex HPX-87H色譜柱：美國(guó)伯樂公司；Q700超聲破碎儀：寧波天生科技有限公司；0.22 μm纖維素膜：廣州市荔灣區(qū)精科玻璃儀器貿(mào)易商行；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；MPR-1411R-PC大容量環(huán)境試驗(yàn)箱：北京西沖科技發(fā)展有限公司；TGL-16型高速臺(tái)式離心機(jī)：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；WP-1型紫外分析儀：溫州永嘉上塘教學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 低溫鍛煉

釀酒酵母BH8在YPD培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)12 h，然后每隔10 min控制溫度下降1 ℃，直到溫度降至13 ℃。以未經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母為對(duì)照，把未經(jīng)鍛煉的釀酒酵母稱為B，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母稱為B1。

1.3.2 低溫發(fā)酵試驗(yàn)

霞多麗葡萄經(jīng)壓榨后，在10 ℃澄清18 h，然后分離出清汁并添加20 mg/L二氧化硫，含糖量調(diào)至200 g/L。利用硫酸銨將含氮量調(diào)至190 mg/L[9]，因酒石酸在葡萄和葡萄酒中均有存在，并且不容易被酵母菌代謝，故利用85%的酒石酸將葡萄汁的pH值調(diào)為3.3。最后添加體積分?jǐn)?shù)為0.2%的二烷酸二甲酯，將葡萄汁于4 ℃靜置48 h，消除微生物的污染[10]。

發(fā)酵液裝液量為400 mL/500 mL，頂部連有發(fā)酵栓，其可使酵母代謝產(chǎn)物二氧化碳排出和發(fā)酵過程中對(duì)發(fā)酵液的取樣，同時(shí)又阻止了外部氧氣的進(jìn)入。起始加入的釀酒酵母約為1×106個(gè)/mL。低溫發(fā)酵試驗(yàn)在13 ℃進(jìn)行，3個(gè)重復(fù)，靜置發(fā)酵。

1.3.3 發(fā)酵液密度測(cè)定及細(xì)胞活性分析

發(fā)酵液密度（ρ）的測(cè)定通過稱取5 mL（v）發(fā)酵液的質(zhì)量（m）求得（ρ=m/v）[11]；活細(xì)胞數(shù)的測(cè)定通過亞甲基藍(lán)染色后的鏡檢結(jié)果計(jì)算[12]；發(fā)酵速度用失重表示，為整個(gè)裝置每天所減輕二氧化碳質(zhì)量，二氧化碳質(zhì)量即從發(fā)酵栓中溢出的氣體質(zhì)量測(cè)定，每天定時(shí)對(duì)發(fā)酵栓中發(fā)酵液進(jìn)行搖勻，使二氧化碳從發(fā)酵栓中溢出直至無氣泡溢出時(shí)，對(duì)整個(gè)發(fā)酵裝置稱質(zhì)量。當(dāng)二氧化碳的減少量＜0.2 g/（L·d）時(shí)認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵速度計(jì)算公式如下：

式中：V為發(fā)酵速度，g/（L·d）；M1為裝置第N天的總質(zhì)量，g；M2為裝置第N+1天的總質(zhì)量，g；v為發(fā)酵液的體積，L；d為時(shí)間，d。

1.3.4 理化指標(biāo)的測(cè)定

葡萄糖、果糖、海藻糖、甘油、琥珀酸、乙酸和乙醇含量通過高效液相色譜測(cè)定[13]。將上清液先通過0.22 μm的纖維素膜過濾，再經(jīng)過Aminex HPX-87H色譜柱，流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸，流速0.6 mL/min，柱溫65 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5 酶活性的測(cè)定

將干質(zhì)量約10 mg的酵母懸浮于20 mmol/L 4 ℃的羥乙基哌嗪乙磺酸（hepes）（pH 7.1）緩沖溶液中30 min，利用超聲破碎儀使釀酒酵母細(xì)胞破碎[14]，將溶液在18 000×g，4 ℃離心30 min，所得上清液為粗酶液。

3-磷酸甘油脫氫酶（3-glycerophosphate dehydrogenase，GPD）的測(cè)定：依賴于NAD+的3-磷酸甘油脫氫酶是酵母菌甘油合成的關(guān)鍵酶。此酶活的測(cè)定是按照參考文獻(xiàn)[15]的方法，略有改動(dòng)。反應(yīng)溶液包含20mmol/L（pH7.1）的Hepes緩沖液、20 mmol/L氯化鉀、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5 mmol/L磷酸二羥基丙酮（DHAP）和0.1 mmol/L NADH。反應(yīng)溫度為30 ℃，加入DHAP后反應(yīng)開始，NADH的減少通過波長(zhǎng)340 nm條件下紫外分光光度計(jì)測(cè)定。溶液中蛋白質(zhì)含量的減少量就相當(dāng)于消耗的GPD酶量，蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[17]。GPD酶活被定義為每分鐘消耗1 μmol的NADH所需的酶量，以U/g表示，計(jì)算公式如下：

式中：U為GPD酶活性，U/g；ΔA為單位時(shí)間內(nèi)的吸光度值變化；E為消光系數(shù)，ε340=6.2×103/（mmol·cm-1）[16]；L為液層的厚度，cm。

乙醇脫氫酶（ethanol dehydrogenase，ADH）的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[18]的方法，略有改動(dòng)。反應(yīng)溶液包括50 mmol/L磷酸二氫鉀，1.0 mmol/L NAD+，pH值為8.0，反應(yīng)開始加入100 mmol/L的乙醇，反應(yīng)溫度為30 ℃，波長(zhǎng)340 nm條件下紫外分光光度法測(cè)定吸光度值?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫鍛煉對(duì)酵母發(fā)酵動(dòng)力及其主要代謝物的影響

發(fā)酵溫度和酵母菌種都能夠影響發(fā)酵速率、發(fā)酵時(shí)間、酵母生長(zhǎng)及代謝物的含量，13 ℃條件下普通酵母菌和低溫鍛煉酵母菌對(duì)各種指標(biāo)的影響見表1。由表1可知，與對(duì)照相比，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母B1發(fā)酵時(shí)間縮短2 d，發(fā)酵效率提高了7.41%；最大活菌數(shù)增加了8.33%；殘?zhí)橇拷档土?6.28%；乙醇含量增加了4.04%；乙酸含量降低了6.70%。

表1 低溫發(fā)酵對(duì)于釀酒酵母發(fā)酵動(dòng)力及其主要代謝物的影響Table 1 Effect of low temperature on fermentation kinetics and main metabolites of strains

目前研究已經(jīng)證實(shí)甘油、海藻糖和琥珀酸等物質(zhì)具有抗低溫的性質(zhì)，在低溫發(fā)酵條件下酵母細(xì)胞會(huì)大量產(chǎn)生這些抗性物質(zhì)使發(fā)酵得以繼續(xù)進(jìn)行[19]。然而與對(duì)照相比，經(jīng)過低溫鍛煉的酵母產(chǎn)生的抗性物質(zhì)卻有所下降，其甘油產(chǎn)量下降了4.17%；海藻糖產(chǎn)量下降了20.53%；琥珀酸產(chǎn)量下降了2.61%。這種情況的產(chǎn)生很可能是釀酒酵母在低溫鍛煉過程中已經(jīng)產(chǎn)生了抗低溫的能力。

2.2 低溫鍛煉對(duì)乙醇、殘?zhí)呛虯DH活性動(dòng)力曲線的影響

圖1 低溫發(fā)酵對(duì)酵母B和B1的殘?zhí)橇?、乙醇產(chǎn)量(A)和ADH活性(B)的影響Fig.1 Effect of low temperature fermentation with yeast B and B1 on residual sugar,ethanol production(A) and ADH activity(B)

圖1A顯示酵母菌B和B1在13 ℃發(fā)酵條件下糖的消耗和乙醇含量的變化趨勢(shì)。由于受到低溫的影響，兩種酵母菌進(jìn)入到酒精發(fā)酵的時(shí)間都比較晚，大約5 d左右發(fā)酵才開始啟動(dòng)。13 d后酒精發(fā)酵和糖的利用率都明顯的減慢，未經(jīng)低溫鍛煉和經(jīng)過低溫鍛煉的菌株分別在第27天和第25天完成了酒精發(fā)酵的過程，各自產(chǎn)生12.14%和12.63%的乙醇，殘留1.72 g/L和1.44 g/L的糖。

圖1B顯示低溫發(fā)酵下ADH活性的動(dòng)力曲線。未經(jīng)低溫鍛煉和經(jīng)過低溫鍛煉的菌株ADH活性都在第8天達(dá)到最大值，并且ADH活性在6～13 d都處于較大值。較為不同的是，經(jīng)過低溫鍛煉的菌株其ADH活性比未經(jīng)過低溫鍛煉的要高。這也使得經(jīng)過低溫鍛煉的B1更快地完成酒精發(fā)酵，并且產(chǎn)生更多的乙醇和更少的殘?zhí)恰?/p>

2.3 低溫鍛煉對(duì)甘油和GPD活性動(dòng)力曲線的影響

低溫發(fā)酵對(duì)釀酒酵母B和B1的甘油產(chǎn)量和GPD活性的動(dòng)力學(xué)影響見圖2。

圖2 低溫發(fā)酵對(duì)酵母B和B1的甘油產(chǎn)量和GPD活性的影響Fig.2 Effect of low temperature fermentation with yeast B and B1 on glycerol production and GPD activity

由圖2可知，低溫發(fā)酵條件下，發(fā)酵10 d以后，未經(jīng)低溫鍛煉和經(jīng)過低溫鍛煉的菌株甘油積累都明顯減緩，并且其前10 d的產(chǎn)量分別到達(dá)總產(chǎn)量的70.4%和63.1%。最終甘油的產(chǎn)量分別為10.78 g/L和10.33 g/L。GPD活性最大值都在發(fā)酵第4天達(dá)到，然后酶活性迅速下降，10 d后趨于平緩。與未經(jīng)低溫鍛煉的菌株略有不同的是，經(jīng)過低溫鍛煉的菌株的GPD活性在第16天稍有增加，而未經(jīng)低溫鍛煉的菌株B則平緩的下降。

3 結(jié)論

結(jié)果顯示，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母其發(fā)酵速率和酵母活菌數(shù)均高于未經(jīng)鍛煉的釀酒酵母，從而使酒精發(fā)酵時(shí)間縮短，有利于成本的節(jié)約。造成這種結(jié)果的原因有可能在于經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母可以使LOT1基因誘導(dǎo)表達(dá)，增加了酵母體內(nèi)的不飽和脂肪酸的含量，從而增強(qiáng)了酵母耐受低溫的抗性，使活菌數(shù)增加，發(fā)酵速率加快。另外，又可使酵母耐受酒精的能力增強(qiáng)[20]。

葡萄酒發(fā)酵過程中，釀酒酵母需要持續(xù)應(yīng)對(duì)多種脅迫條件。為了能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，其產(chǎn)生了多個(gè)抗性分子，其中包括甘油、海藻糖、琥珀酸等。然而經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母在產(chǎn)生這些抗性分子方面卻少于未經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母。造成這種情況的原因有可能是經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母使得體內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生了針對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答，或者其產(chǎn)生了許多的抗低溫的分子，比如糖原等[21]。

酒精發(fā)酵過程中，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母酒精產(chǎn)量比未經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母增加了4.04%，殘?zhí)橇肯陆盗?6.28%，ADH的活性也有所提高。這些結(jié)果很可能是由于低溫鍛煉的釀酒酵母使ADH1基因表達(dá)量增加，從而提高了ADH的活性，使其產(chǎn)生更多的乙醇。另外，這也可能是因?yàn)榻?jīng)過低溫鍛煉使釀酒酵母活菌數(shù)增加，提高了糖的利用率，從而提高了乙醇產(chǎn)量。

葡萄酒發(fā)酵過程中，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母其GPD酶的最大活性略低于未經(jīng)低溫鍛煉的釀酒酵母，而且在整個(gè)發(fā)酵的前期過程中也略低于對(duì)照組，最終的甘油、海藻糖和琥珀酸等具有抗低溫性質(zhì)的物質(zhì)產(chǎn)量也低于對(duì)照組，但經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母的乙醇產(chǎn)量卻高于對(duì)照組。結(jié)果表明，雖然低溫鍛煉使釀酒酵母GPD酶活性略有降低，但經(jīng)過低溫鍛煉使釀酒酵母產(chǎn)生了抗低溫的性質(zhì)。

經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母如果能適應(yīng)低溫發(fā)酵的脅迫條件，對(duì)于很多只能在低溫發(fā)酵的葡萄酒酒種質(zhì)量的提高將會(huì)有很大的幫助，并且這種研究對(duì)于馴化篩選適應(yīng)低溫發(fā)酵的釀酒酵母都有理論的意義。

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