侯靖宇，潘　潔，謝玉敏，陳鵬程，王永林，王愛民

(貴陽醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽　550004)

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大鼠在體腸吸收杜仲中幾種成分的特征研究

侯靖宇1，潘潔1，謝玉敏1，陳鵬程1，王永林1，王愛民2

(貴陽醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004)

Characteristics of rat’s intestinal absorption of several components from Eucommia ulmoides

HOU Jing-yu1，PAN Jie1，XIE Yu-min1，CHEN Pengcheng1，WANG Yong-lin1，WANG Ai-min2
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，School of Pharmacy，2.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China)

Key words:Eucommia ulmoides; in situ intestinal perfusion model; UPLC-MS/MS; pH value; bile; intestinal absorption

杜仲為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮，其味甘，性溫，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，為國(guó)家二級(jí)珍稀樹種，是傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)藥材。有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等功效，主要用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈?zāi)垦?、妊娠漏血、胎?dòng)不安等疾?。?－3］。

課題組在前期工作中采用Caco-2細(xì)胞模型研究杜仲提取物的攝取機(jī)制以及不同因素影響下杜仲提取物的攝取特點(diǎn)［2］。本文進(jìn)一步采用大鼠在體腸循環(huán)灌流模型［4］，以原兒茶酸、松脂醇單葡萄糖苷和松脂醇二葡萄糖苷為考察對(duì)象，對(duì)杜仲提取物的腸吸收特性進(jìn)行研究，并探討其在不同因素影響下的腸吸收動(dòng)力學(xué)特征，為杜仲的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供必要的科學(xué)依據(jù)。

1　材料

1.1儀器與試藥超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司) ; ZH-2渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠) ; Allegra 64R高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司) ; MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司) ; EL204電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司) ; HL-2S蠕動(dòng)泵(上海青浦滬西儀器廠) ; DK-98-ⅡA恒溫水裕鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

葛根素(內(nèi)標(biāo)，批號(hào):111-0906623，中國(guó)藥品生物制品鑒定所) ;原兒茶酸(批號(hào):110306，四川省維克奇生物科技有限公司) ;松脂醇二葡萄糖苷(批號(hào):201206，上海順勃生物工程有限公司) ;松脂醇單葡萄糖苷(批號(hào):201206，江蘇弘惠醫(yī)藥有限公司) ;烏拉坦(上海行知化工廠) ;鹽酸維拉帕米(阿拉丁) ;杜仲提取物(自制，批號(hào): 20130823) ;甲醇、乙腈為色譜純; Krebs-Ringer’s(K-R)營(yíng)養(yǎng)液(NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g及MgCl20.02 g，加500 mL蒸餾水溶解，0.37 g CaCl2、葡萄糖1.4 g溶于500 mL蒸餾水，兩者混勻即可)。

1.2動(dòng)物健康SD大鼠(♀♂各半)，體質(zhì)量200～240 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。批號(hào): SCXK(黔) 2014－0003。

2　方法

2.1色譜條件色譜柱: Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱，流動(dòng)相:0.1%甲酸乙腈(A)－0.1%甲酸水(B)，梯度為0～0.5 min: 5%～10% (A)，0.5～3.5 min: 10%～20% (A)，3.5～4 min: 20%～90% (A)，4～5 min: 90%～5%(A) ;流速: 0.30 mL·min－1;柱溫: 45℃;進(jìn)樣體積:1 μL。

2.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)，毛細(xì)管電壓:3 kV，離子源溫度120℃;噴霧氣與反吹氣: N2，去溶劑氣流速650 L ·h－1，溫度350℃;反吹氣流速50 L·h－1;掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)。原兒茶酸: m/z(－) 152.9→109、松脂醇二葡萄糖苷: m/z(－) 681.3→357.2、松脂醇單葡萄糖苷: m/z(－) 519.3→357.2及葛根素: m/z(+ ) 417→267。

2.3供試藥液的制備取適量杜仲提取物，加入適量K-R營(yíng)養(yǎng)液，超聲使溶解，10 000 r·min－1離心5 min，取上清液備用，獲得2.0、4.0、8.0 mg·L－1的供試液。

2.4在體腸吸收實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［5－6］，本實(shí)驗(yàn)據(jù)其具體內(nèi)容并進(jìn)行適當(dāng)修改，對(duì)大鼠麻醉后固定進(jìn)行手術(shù)，取50 mL腸循環(huán)液以5 mL·min－1流速循環(huán)10 min，再以2.5 mL· min－1的速度繼續(xù)回流，立即讀出循環(huán)液體積并取樣1 mL，另向量筒中補(bǔ)加K-R緩沖液1 mL，其后每隔30 min亦按同法讀數(shù)，取樣并補(bǔ)加等體積K-R緩沖液，循環(huán)3 h后中止。取腸灌流樣品溶液100μL，加20μL20.03mg·L－1內(nèi)標(biāo)溶液，400 μL甲醇及100 μL 0.1%的甲酸，渦混1 min，15 000 r ·min－1離心5 min，取上清液進(jìn)樣UPLC-MS/MS分析。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析同參考文獻(xiàn)［6］

3　結(jié)果

3.1不同pH值及濃度的考察對(duì)3個(gè)成分在不同pH條件及不同濃度下累計(jì)吸收常數(shù)(A)進(jìn)行方差分析比較，pH=6.0時(shí)，各成分的3 h累計(jì)吸收量相對(duì)較高。原兒茶酸在低濃度時(shí)A%明顯高于中、高濃度(P＜0.05)，松脂醇單葡萄糖苷在中濃度時(shí)A%明顯低于高濃度(P＜0.05) ;提示其在體內(nèi)的吸收機(jī)制可能為被動(dòng)吸收，見Tab 1、2。

3.2膽汁及P-gp抑制劑對(duì)3種成分吸收的影響3種成分在結(jié)扎膽管及維拉帕米抑制P-gp條件下的累計(jì)吸收常數(shù)(A)經(jīng)方差分析，表明膽汁對(duì)3種成分的吸收均具有抑制作用(P＜0.05)，加入P-gp抑制劑后原兒茶酸吸收明顯增加(P＜0.05)，結(jié)果見Tab 3。

3.3不同腸段中3個(gè)成分的累計(jì)吸收常數(shù)(A)和Ka比較

對(duì)3個(gè)成分在不同腸段的累計(jì)吸收常數(shù)(A)進(jìn)行方差分析，原兒茶酸在空腸的累積吸收量較回腸大(P＜0.05)。3種成分在不同腸段的吸收趨勢(shì)，原兒茶酸:空腸＞回腸＞十二指腸＞結(jié)腸;松脂醇二葡萄糖苷:回腸＞空腸＞十二指腸＞結(jié)腸;松脂醇單葡萄糖苷:十二指腸＞回腸＞空腸＞結(jié)腸。見Tab 4。

Tab 1 A% and Ka of three components in different pH values±s，n=4)

Tab 1 A% and Ka of three components in different pH values±s，n=4)

A%:*P＜0.05 vs pH 7.4

Group pH=7.4pH=6.86pH=6.0pH=5.0 A%　KaA%　KaA%　KaA%　Ka Protocatechuic acid　31.9±2.2 0.10±0.02　38.2±14.1　0.15±0.07　44.6±3.8　0.19±0.08　40.4±4.90.17±0.04 Pinoresinol diglucoside　23.8±3.2 0.06±0.04　20.7±1.8　0.06±0.02　24.2±4.3　0.07±0.02　29.7±3.2*0.11±0.05 Pinoresinol singleglucoside　33.0±3.6 0.12±0.02　23.6±3.3*　0.10±0.05　28.7±7.2　0.09±0.03　31.7±4.4　0.13±0.04

Tab 2 A% and Ka of three components in different concentrations (珋±s，n=4)

Tab 2 A% and Ka of three components in different concentrations (珋±s，n=4)

Ka:*P＜0.05 vs high concentration; A%:△P＜0.05 vs high concentration;#P＜0.05 vs low concentration

2.0 mg·L－14.0 mg·L－18.0 mg·L－1Group　A%　Ka A%　Ka A%　Ka Protocatechuic acid　52.6±6.9　0.21±0.05*　50.1±2.4#　0.26±0.05　45.0±7.3#0.21±0.06 Pinoresinol diglucoside　29.3±5.5　0.10±0.01*　32.3±4.1　0.13±0.02　32.1±1.0　0.13±0.03*Pinoresinol singleglucoside　27.6±3.8　0.11±0.03　51.7±7.8#△　0.23±0.06　49.7±5.1　0.20±0.04*

Tab 3 A% and Ka of three components with ligation of the bile duct and addition of verapamil(珋±s，n=4)

Tab 3 A% and Ka of three components with ligation of the bile duct and addition of verapamil(珋±s，n=4)

Ka:*P＜0.05 vs control group; A%:△P＜0.05 vs control group;

Group ControlBile duct ligatedP-gp inhibitors A%　KaA%　KaA%　Ka Protocatechuic acid　25.1±2.8　0.062±0.031　50.1±2.4△　0.262±0.052*　51.9±2.8△　0.251±0.017*Pinoresinol diglucoside　29.1±4.6　0.059±0.009　32.3±4.1　0.127±0.020　31.1±1.8　0.085±0.010 Pinoresinol singleglucoside　32.3±4.5　0.095±0.034　51.7±7.8△　0.230±0.061*31.1±2.9　0.108±0.012

Tab 4 A% and Ka of three components at various intestinal segments (珋±s，n=4)

Tab 4 A% and Ka of three components at various intestinal segments (珋±s，n=4)

Ka:*P＜0.05 vs colon; A%:#P＜0.05 vs ileum

Group DuodenumJejunumIleumColon A%　KaA%　KaA%　KaA%　Ka Protocatechuic acid　37.6±10.7　0.18±0.06　55.6±3.6#　0.23±0.04*43.4±5.6　0.18±0.01　33.1±4.0 0.13±0.03 Pinoresinol diglucoside　20.3±2.5　0.10±0.01　22.4±9.9　0.08±0.04　31.4±3.5　0.07±0.03　17.6±7.1 0.04±0.02 Pinoresinol singleglucoside　24.0±2.5　0.09±0.01　17.7±8.5　0.05±0.02　23.4±0.5　0.07±0.01　12.5±6.3 0.03±0.02

4　討論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，原兒茶酸、松脂醇單葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷在小腸均有吸收，膽汁對(duì)3種成分的吸收存在抑制作用，原兒茶酸可能是P-gp的底物。3種成分的吸收速率與藥物濃度有一定的關(guān)系，3種成分的吸收為一級(jí)吸收動(dòng)力學(xué)，提示其吸收機(jī)制可能是被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

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作者簡(jiǎn)介:侯靖宇(1991－)，女，碩士生，研究方向:藥物生物等效性評(píng)價(jià)與藥代動(dòng)力學(xué)，Tel: 0851-6908468，E-mail: 772964576 @ qq.com;王愛民(1962－)，男，教授，研究方向:中藥新藥的研究與開發(fā)，通訊作者，Tel: 0851-6908899，E-mail: gywan100 @ 163.com

基金項(xiàng)目:貴州省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(黔科合重大專項(xiàng)字［2012］6009號(hào)) ;貴州省中藥現(xiàn)代化研究開發(fā)專項(xiàng)(黔科合中藥字［2013］5062號(hào)，黔科合重G字［2013］4001號(hào)) ;貴州高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃(黔教合協(xié)同創(chuàng)新字［2013］04)?

收稿日期:2015－01－25，修回日期:2015－03－25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015) 06－0885－03中國(guó)圖書分類號(hào): R-332; R282.71; R284.1; R322.45; R333.3關(guān)鍵詞:杜仲提取物;在體腸灌流模型; UPLC-MS/MS; pH 值;膽汁;腸吸收

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.030